水稻品质性状基因的基因编辑及应用制造技术

本发明专利技术属于农作物领域，尤其涉及粳稻品种品质改良育种香味控制和淀粉合成基因的基因编辑方法及其应用。本发明专利技术公开了一种基因编辑转化载体，其以pCambia3301为载体骨架，还包括ZmU6启动子、ZmUBI1启动子；还包括针对Badh2和Waxy基因的不同外显子区域可识别位点设计的多个gRNA片段；所述gRNA片段位于所述ZmU6启动子、ZmUBI1启动子之间，且通过ZmU6启动子进行同步表达；所述gRNA片段通过tRNA技术交互连接。本发明专利技术通过构建基因编辑遗传转化载体，用农杆菌介导方法转化粳稻品种，实现了再生植株Badh2和Waxy基因目标区域核苷酸序列的多种编辑，并最终获得了具有香味的糯稻、非转基因、稳定遗传的纯合编辑水稻品系。定遗传的纯合编辑水稻品系。定遗传的纯合编辑水稻品系。

【技术实现步骤摘要】
水稻品质性状基因的基因编辑及应用


[0001]本专利技术属于农作物领域，尤其涉及粳稻改良品系香味控制基因和淀粉合成酶基因的基因编辑方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来快速发展的基因编辑技术利用特异性核酸内切酶选择性切断细胞中的特定基因，通过细胞固有的两种DNA修复机制，非同源末端链接Non
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homologous end joining(NHEJ)和同源依赖修复Homology dependent repair(HDR)，修复断口，保障细胞存活。NHEJ的修复效率高，不需要模板，占主导地位，但切断点链接过程会引入插入或缺失突变，从而使基因失活；HDR需要依照模板，虽然修复精准，但所占比例很小，如果提供预先设计好的DNA片段作为模板，可以将该片段定点插入预选位点，将目标基因修改，但是效率极低，严重影响其广泛应用。两种编辑途径产生的后代经遗传分离后最终产品均可不含任何外源DNA，为非转基因产品，并且已经被许多国家相关管理部门认定为与常规育种产品等同，因此可以避免复杂昂贵的转基因产品监管审批过程和费用，适宜于快速生产应用。
[0003]基于酿脓链球菌Streptococcus pyogenes获得性免疫系统CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)的基因编辑技术2013年首次实现体内基因编辑(Jinek et al.,2012,Science 337:816
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821；Cong et al.,2013,Science 339:819
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823；Mali et al.,2013,Science 339:823
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826)，Cas9核酸内切酶与导引gRNA形成核蛋白酶复合体，通过gRNA中20bp长的RNA序列与被编辑DNA序列的碱基配对识别目标，特异性高，酶切活性强，实验设计简单易行，使得CRISPR/Cas9基因编辑系统迅速在不同动植物系统中得到广泛的成功应用，也是基因编辑技术植物育种的优选方法，实现了多种植物大量基因的以NHEJ途径为主的敲除编辑以及少数HDR介导的精准设计编辑(Li et al.,2015Plant Physiol 169:960
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970；Ma et al.,2016,Mol Plant 9:961
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974；Chen et al.,2019,Annu Rev Plant Biol 70:667
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97；Mao et al.,2019,Natl Sci Rev 6:421
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437)。结合多重gRNA同步表达技术，CRISPR/Cas9技术可以同时对多个基因多个位点进行高效NHEJ途径编辑，实现多种性状的同步改良(Xie et al.,2015,Proc Natl Acad Sci USA 112:3570
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3575；Hsieh
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Feng and Yang 2020,aBIOTECH:doi.org/10.1007/s42994
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019
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00014
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w)。但由于通过HDR途径的CRISPR/Cas9编辑效率往往远低于1％，而许多疾病治疗和育种改良需要对基因序列进行精准的编辑而不是简单敲除，因此迫切需要高效精准的改进HDR或替代基因编辑技术。
[0004]近期研发的单碱基编辑技术包括胞嘧啶编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺瞟呤编辑器(Adenine base editor,ABE)可以分别通过不可逆的C
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T或A
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G转换实现单个碱基的特定编辑，无需DNA双链断裂诱导的NHEJ或HDR修复途径参与。胞嘧啶编辑器由胞嘧啶核苷脱氨酶(Cytidine deaminase)和突变的nSpCas9(D10A)核酸切口酶或失活的dSpCas9核酸内切酶融合形成(Kim et al.,2017,Nat Biotechnol 35:371
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376；Komor et al.,2016,Nature 533:420
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424；Nishida et al.,2016,Science 353:aaf8729)，可以在动
植物细胞中将Cas9
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gRNA识别序列的第4到第8位窗口间的胞嘧啶有效地转换成胸腺嘧啶(Li et al.,2017,Mol Plant 10:526
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529；Lu and Zhu,2017,Mol Plant 10:523
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525)。腺嘌呤编辑器由腺嘌呤核苷脱氨酶和突变的nSpCas9(D10A)核酸切口酶融合形成，可以类似地将腺嘌呤转换成鸟嘌呤(Gaudelli et al.,2017,Nature 551:464
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471)，并也已成功的用于植物单碱基编辑(Hua et al.,2018,Mol Plant 11:627
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630；Yan et al.,2018,Mol Plant 11:631
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634)。通过借助CBE和ABE两种编辑器，4种DNA碱基转换突变C
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T,G
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A和A
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G,T
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C都可以实现，但尚没有任何单碱基编辑器可以实现包括C
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A,C
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G,G
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C,G
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T,A
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C,A
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T,T
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A,T
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G的DNA碱基置换编辑。
[0005]因为CBE和ABE两种编辑器只能编辑大概5个碱基窗口中的对应单碱基，可以编辑的位点数直接受制于是否存在SpCas9要求的PAM序列，这种限制可以通过使用对PAM序列要求较为宽松的特殊SpCas9突变体例如xCas9,Cas
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NG，和SpG而突破(Hu et al.,2018,Nature 556:57
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63；Kleinstiver et al.,2015,Nature 523:481
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485；Nishimasu et al.,2018,Science 361:1259
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1262；Walton et al.,2020,Science 368：290
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296)，这些突变的SpCas9除识别NGG之外，能够不同程度地识别NGH(H＝A,C,T)PAM序列，有效地扩大了可以进行各类编辑的目标基因识别位点。
[0006]最新研发并成功应用的导引编辑技术(Prime editing)在精准基因编辑方面取得了突破性进展(Anzalone et al.,2019,Nature 576:14本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO：64
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68所示，Waxy基因分别如SEQ ID NO：69
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73所示。12.一种植株，其特征在于，所述植株以权利要求9
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11所述的后代植株为原材料进行育种得到。13.如下应用：(a)根据权利要求1所述的基因编辑转化载体或权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李忠森，王明月，马瑞，朱婷，刘丹，徐希德，李强，马红友，
申请(专利权)人：北大荒垦丰种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：