一种白腐真菌锰过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用制造技术

本发明专利技术一种白腐真菌锰过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术提供了编码白腐真菌(Gelatoporia subvermispora)B来源的锰过氧化物酶的基因，并将该基因实现了异源表达。将表达的锰过氧化物酶用于聚乙烯薄膜的降解，结合紫外预处理方法，可使聚乙烯薄膜部分降解为醛、酮、醇、酸类等小分子化合物，使薄膜表面出现明显刻蚀，亲水性得到明显增强。本发明专利技术提供的降解聚乙烯薄膜的方法，反应条件温和、环境友好，在塑料生物降解领域具备极高的应用前景。降解领域具备极高的应用前景。降解领域具备极高的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种白腐真菌锰过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用


[0001]本专利技术涉及一种白腐真菌锰过氧化物酶在聚乙烯降解中的应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]塑料是以单体为原料，通过加聚或缩聚反应聚合而成的高分子化合物。大部分塑料化学性能稳定，抗腐蚀能力强，制造成本低，是重要的有机合成高分子材料，应用非常广泛。
[0003]根据合成塑料单体连接方式及碳链类型，可将塑料分为聚烯烃类和聚酯类。聚酯类塑料由多元醇和多元酸缩聚而成，主要指聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，由于存在可水解的酯键，在很多报道中已实现了高效降解。聚烯烃类塑料通常是乙烯、丙烯或高级烯烃的聚合物，具有极强的物理化学稳定性，聚烯烃类塑料的生物降解效果甚微，目前还处在微生物筛选和酶类鉴定阶段，关于微生物和酶类的降解途径及机理还未做深入研究。一些众所周知的微生物已被报道为聚烯烃降解菌，如白腐真菌、红球菌、绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、褐单孢菌、粪产碱杆菌、梭菌等。
[0004]聚乙烯(PE)是塑料垃圾的主要来源，加之难以降解。这使得PE塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。.
[0005]目前已报道的PE降解酶主要有锰过氧化物酶(MnP)、多功能氧化酶(VP)、木质素过氧化物酶(LiP)以及漆酶组的多铜氧化酶，但是降解效果比较微弱，且降解过程及机理未作深入研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了编码白腐真菌Gelatoporia subvermispora B来源的锰过氧化物酶的基因，为(a)或(b)：
[0007](a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列DNA分子；
[0008](b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列互补且编码具有锰过氧化物酶活性的蛋白质的DNA分子。
[0009]本专利技术还提供了携带所述基因的表达载体。
[0010]在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET载体。
[0011]在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET
‑
24a(+)质粒。
[0012]在一种实施方式中，所述基因位于pET
‑
24a(+)质粒的Nde I/EcoR I位点之间。
[0013]本专利技术还提供表达所述基因的重组微生物细胞。
[0014]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞的宿主为大肠杆菌。
[0015]在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。
[0016]本专利技术还提供一种制备锰过氧化物酶的方法，包括：
[0017](a)在适合于表达所述锰过氧化物酶的条件下培养所述重组微生物细胞；以及
[0018](b)回收所述锰过氧化物酶。
[0019]在一种实施方式中，所述(a)是将所述重组微生物细胞在含碳源、氮源和无机盐的培养基中培养。
[0020]在一种实施方式中，所述(a)是将所述重组大肠杆菌在TB液体培养基中，于30～40℃培养3h至OD
600
＝0.6～1，用IPTG诱导。
[0021]在一种实施方式中，所述IPTG诱导是在20～28℃培养至少16h。
[0022]在一种实施方式中，所述(b)包括：收集步骤(a)培养的细胞，破碎细胞并收集细胞破碎物，对细胞破碎物中的包涵体作变性、复性处理。
[0023]在一种实施方式中，所述变性是将所述包涵体溶于含尿素、EDTA、DTT和甘油的Tris
‑
HCl缓冲液中，于0～4℃静置4
‑
5h。
[0024]在一种实施方式中，所述复性是将蛋白变性液在含有尿素、谷胱甘肽、DTT、EDTA、CaCl2、甘油和血红素的Tis
‑
HCl缓冲液中，于0～4℃静置透析20～24h，再加入血红素孵育至少10h。
[0025]本专利技术还提供了所述方法制备的含锰过氧化物酶的产品。
[0026]在一种实施方式中，所述产品包括但不限于锰过氧化物酶酶制剂。
[0027]在一种实施方式中，所述酶制剂含有锰过氧化物酶和蛋白保护剂。
[0028]本专利技术还提供了锰过氧化物酶在降解聚乙烯或含聚乙烯的产品中的应用；所述锰过氧化物酶的氨基酸序列如Genbank：EMD37370.1所示。
[0029]在一种实施方式中，所述产品为聚乙烯薄膜。
[0030]在一种实施方式中，所述锰过氧化物酶在酶解体系中的浓度≥1U/mL。
[0031]在一种实施方式中，所述酶解体系含有：Mn
2+
、Tween 80、苹果酸缓冲液。
[0032]在一种实施方式中，所述Mn
2+
由含锰离子的金属盐提供；所述金属盐包括但不限于MnSO4、MnCl2、Mn(NO3)2。
[0033]在一种实施方式中，酶解反应的温度为30
‑
40℃、pH为4.5～5.5。
[0034]在一种实施方式中，所述降解温度为30℃，降解时间为72h。
[0035]在一种实施方式中，所述苹果酸缓冲液是50mM，pH 4.5的苹果酸
‑
苹果酸钠缓冲液。
[0036]在一种实施方式中，酶解反应前还进行了紫外预处理。
[0037]在一种实施方式中，所述降解包括如下步骤：
[0038](1)将聚乙烯薄膜在T＝70℃，UV辐射强度为200V的紫外灯下照射至少4天，每隔20～24h对聚乙烯薄膜进行翻面处理；
[0039](2)将步骤(1)紫外预处理后的PE薄膜在pH4.5～5.5，含0.1mM MnSO4、0.1％(v/v)Tween 80、50mM苹果酸
‑
苹果酸钠缓冲液的反应体系中反应；反应温度为30～40℃，反应至少48h，或至少60h，或至少72h。
[0040]本专利技术还提供了所述锰过氧化物酶或所述方法在降解塑料制品方面的应用。
[0041]有益效果：
[0042](1)本专利技术提供了编码异源锰过氧化物酶的新基因，并构建了异源表达锰过氧化物酶的重组大肠杆菌，实现了白腐真菌(Gelatoporia subvermispora)B来源的锰过氧化物酶在大肠杆菌中的异源表达。
[0043](2)本专利技术提供了锰过氧化物酶在降解聚乙烯薄膜中的应用，将锰过氧化物酶在含有经紫外预处理的聚乙烯薄膜(UVPE)的反应体系中，在30℃，200rpm条件下反应72h，可使紫外处理聚乙烯薄膜(UVPE)部分降解为醛、酮、醇、酸类等小分子化合物，其薄膜表面存在明显刻蚀，亲水性得到明显增强。本专利技术提供的聚乙烯薄膜降解方法反应条件温和、环境友好，具备极高的应用前景。
附图说明
[0044]图1为锰过氧化物酶的SDS
‑
PAGE验证结果图；其中，M：蛋白Marker(KDa)；1：0.29mg/mL复性蛋白(37kDa)2：5OD菌体破壁沉淀。
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码白腐真菌来源的锰过氧化物酶的基因，其特征在于，为(a)或(b)：(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列DNA分子；(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列互补且编码具有锰过氧化物酶活性的蛋白质的DNA分子。2.携带权利要求1所述基因的表达载体。3.表达权利要求1所述基因的重组微生物细胞。4.一种制备锰过氧化物酶的方法，其特征在于，包括：(a)在适合于表达所述锰过氧化物酶的条件下培养权利要求3所述的重组微生物细胞；以及(b)回收所述锰过氧化物酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)是将所述重组微生物细胞在含碳源、氮源和无机盐的培养基中培养；可选地，采用诱导剂诱导锰过氧化物酶的表达。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，夏伟，窦明德，姚从禹，杜妍怡，陈晟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：