一种花生脂氧合酶基因AhLOX29及其克隆与功能表达方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种花生脂氧合酶基因AhLOX29及其克隆与功能表达方法、应用，涉及生物工程的技术领域，其技术方案要点一是在于提供一种花生脂氧合酶基因AhLOX29，其开放阅读框为2754bp，共编码917个氨基酸；二是在于提供一种该基因的克隆与功能表达方法方法，包括以下步骤：S1、材料准备，S2、PCR扩增获得AhLOX29基因全序列，S3、构建AhLOX29基因超表达的载体，S4、农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定，S5、荧光定量PCR对AhLOX29基因表达进行分析，S6、转基因T2代拟南芥幼苗干旱胁迫处理及表型观察；三是在于提供该基因AhLOX29的应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种花生脂氧合酶基因AhLOX29及其克隆与功能表达方法、应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，更具体地说，它涉及一种花生脂氧合酶基因AhLOX29及其克隆与功能表达方法、应用。

技术介绍

[0002]花生是世界优质植物油脂和蛋白质的核心来源之一。我国是世界第一花生生产大国，种植面积近7000万亩，居世界第二位；年产约1700万吨，居全球首位，在我国油料作物中总产量、总产值、出口量均第一位。但是，花生的产量和品质受到干旱威胁较为严重。据统计，我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％；此外，干旱胁迫还会增加黄曲霉毒素污染几率。国际半干旱作物研究所(I
‑
CRISAT)研究认为，由干旱造成的约一半的损失可以通过遗传改良提高花生抗旱能力而避免。传统育种方法虽然也能使花生的抗旱能力有所提高，但总的来说进展缓慢。随着现代分子生物学、生物技术的发展，近年来抗逆基因的研究已取得显著进展，但花生中可供有效利用的基因资源相对缺乏。因此，挖掘抗旱相关基因，阐明抗旱分子机理具有重要意义。
[0003]脂氧合酶(LOX)是一种含非血红素的双加氧酶，在植物、动物和真菌中广泛存在，并已形成多个亚家族。在植物中，LOX催化脂肪酸氧化形成氢过氧衍生物，催化的底物主要是不饱和脂肪酸，包括α
‑
亚油酸(18:2)、α
‑
亚麻酸(18:3)和十六碳三烯酸(16:3)等。根据催化底物位点的特异性(即在多不饱和脂肪酸碳9或13的位置加氧)，植物LOX可分为两个亚家族9
‑<br/>LOX和13
‑
LOX。LOX是茉莉酸生物合成途径中的一种关键酶，有研究表明，水分胁迫下LOX活性与茉莉酸含量呈极显著正相关，抑制LOX酶活性后茉莉酸含量也显著减少。目前植物中只发现过表达拟南芥AtLOX6和玉米ZmLOX6可显著提高植物的抗旱性，关于花生LOX基因功能的报道较少，而关于其抗旱功能的研究还未有报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种花生脂氧合酶基因AhLOX29；本专利技术的第二个目的在于提供一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法；本专利技术的第三个目的在于提供一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的应用。
[0005]为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种花生脂氧合酶基因AhLOX29，所述AhLOX29基因开放阅读框为2754bp，共编码917个氨基酸；所述AhLOX29基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0006]为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法，包括以下步骤：
[0007]S1、材料准备；
[0008]S2、PCR扩增获得AhLOX29基因全序列；
[0009]S3、构建AhLOX29基因超表达的载体；
[0010]S4、农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定；
[0011]S5、荧光定量PCR对AhLOX29基因表达进行分析；
[0012]S6、转基因T2代拟南芥幼苗干旱胁迫处理及表型观察。
[0013]进一步地，步骤S2中，PCR扩增所述花生脂氧合酶AhLOX29的引物为AhLOX29
‑
F和AhLOX29
‑
R，其中：
[0014]AhLOX29
‑
F：5
’‑
TTTGGTACATCTTAAGTCAATAAG
‑3’
，
[0015]AhLOX29
‑
R：5
’‑
CTATTCCGGAGTAAGTTTGATT
‑3’
。
[0016]进一步地，步骤S4中，PCR检测筛选阳性转基因植株的引物为GUS
‑
F和GUS
‑
R，其中，GUS
‑
F：GTGACAAAAACCACCCAAG，
[0017]GUS
‑
R：CTTTCTTGTTACCGCCAAC。
[0018]进一步地，步骤S5中，使用荧光定量RT
‑
PCR对AhLOX29基因干旱下的表达进行分析，所述的AhLOX29基因荧光定量引物序列如下：
[0019]AhLOX29
‑
RT
‑
F：5
’‑
CACATAATTAGCCACTTGGACG
‑3’
，
[0020]AhLOX29
‑
RT
‑
R：5
’‑
TACGAGTTGCATATGCTTTTCG
‑3’
。
[0021]进一步地，步骤S5中，AhLOX29基因定量PCR的正向引物序列为：
[0022]AhLOX29
‑
RT
‑
F：5
’‑
CACATAATTAGCCACTTGGACG
‑3’
，
[0023]AhLOX29
‑
RT
‑
R：5
’‑
TACGAGTTGCATATGCTTTTCG
‑3’
。
[0024]进一步地，步骤S5中，使用Actin作为RT
‑
PCR的内参基因，所述的内参基因Actin所用引物序列为：
[0025]Actin
‑
F:5
’‑
TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC
‑3’
，
[0026]Actin
‑
R:5
’‑
AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC
‑3’
。
[0027]为实现上述第三个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的应用，可提高植物的抗旱性。
[0028]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0029]第一、本专利技术首次发现了花生脂氧合酶基因AhLOX29，通过研究验证，该基因可提高植物的抗旱性。
[0030]第二、本专利技术的方法，通过荧光定量PCR验证了AhLOX29在干旱胁迫下的表达模式，该基因干旱胁迫下在叶片和根部的转录水平均有明显升高，干旱胁迫处理后叶片和根中AhLOX29基因的相对表达量一直处于上升趋势，在24小时达到峰值，初步验证了该基因能够响应干旱胁迫。
附图说明
[0031]图1是本专利技术20％PEG6000胁迫处理后花生AhLOX29基因在不同时间段和不同部位的表达模式分析。
[0032]图2是本专利技术中过表达花生AhLOX29基因T2代拟南芥种子在干旱胁迫下的表现。
具体实施方式
[0033]以下结合实施例对本专利技术作进一步详细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花生脂氧合酶基因AhLOX29，其特征在于，所述AhLOX29基因开放阅读框为2754bp，共编码917个氨基酸；所述AhLOX29基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。2.一种如权利要求1所述的花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、材料准备；S2、PCR扩增获得AhLOX29基因全序列；S3、构建AhLOX29基因超表达的载体；S4、农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定；S5、荧光定量PCR对AhLOX29基因表达进行分析；S6、转基因T2代拟南芥幼苗干旱胁迫处理及表型观察。3.根据权利要求2所述的一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增所述花生脂氧合酶AhLOX29的引物为AhLOX29
‑
F和AhLOX29
‑
R，其中：AhLOX29
‑
F：5
’‑
TTTGGTACATCTTAAGTCAATAAG
‑3’
，AhLOX29
‑
R：5
’‑
CTATTCCGGAGTAAGTTTGATT
‑3’
。4.根据权利要求2所述的一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法，其特征在于，步骤S4中，检测筛选阳性转基因植株的引物为GUS
‑
F和GUS
‑
R，其中，GUS
‑
F：GTGACAAAAACCACCCAAG，GUS
‑
R：CTTTCTTGTTACCGCCAAC。5.根据权利要求2所述的一种花生脂氧合酶基因AhLOX29的克隆与功能表达方法，其特征在于，步骤S5中，使用荧光定量RT
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：牟艺菲，单世华，苑翠玲，李春娟，孙全喜，闫彩霞，赵小波，王娟，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：