本发明专利技术涉及一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供了一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，所述方法以细胞工厂作为腮腺炎病毒规模化制备的载体，并且，所述方法通过系统的比较，获得了腮腺炎病毒培养的最佳收换液组合，所述最佳收换液组合为间隔22~26h对病毒培养液进行收获，总共收获三~四次，前两~三次收获后需将新的细胞维持液注入细胞工厂；本发明专利技术提供的方法具有收获次数多，单次病毒收获液和混合病毒收获液的病毒滴度高，以及，细胞病变稳定等诸多优势，与转瓶工艺相比，所述方法生产得到的病毒收获液在质量和产量上均得到了显著的提高，有助于进一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。
【技术实现步骤摘要】
一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法
[0001]本专利技术涉及一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，属于生物医药
技术介绍
[0002]流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的一种急性呼吸道传染病。其主要临床症状为发热、腮腺非化脓性肿痛；部分病例还会继发无菌性脑膜炎、胰腺炎、睾丸炎等；症状严重者可导致伤残或者死亡。流行性腮腺炎在我国属于法定管理的丙类传染病，目前尚缺乏特效药物，且抗生素治疗没有明显效果。现阶段，疫苗的预防接种仍然是对流行性腮腺炎唯一有效的预防和控制手段。
[0003]腮腺炎减毒活疫苗是用于控制流行性腮腺炎的疫苗中的重要产品，具有免疫效果好，免疫作用时间长、不需要佐剂刺激以及制备工艺方便的优势。在腮腺炎减毒活疫苗大量使用以前，全球各地的腮腺炎疫情泛滥；但是随着腮腺炎减毒活疫苗的广泛使用，腮腺炎的发病率被极大的控制。
[0004]腮腺炎减毒活疫苗的制备过程主要包括腮腺炎病毒减毒株的规模化生产（细胞制备+病毒接种+细胞换液+病毒收获）以及澄清两个步骤。其中，规模化生产得到高滴度的腮腺炎病毒减毒株收获液是腮腺炎减毒活疫苗批量化制备的前提条件，会直接影响到腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。
[0005]现阶段，主要通过转瓶工艺实现腮腺炎病毒减毒株的规模化生产。但是，转瓶工艺仍存在很多缺陷，例如，单个转瓶的细胞饲养面积有限，规模化生产需要大量转瓶，无菌控制风险更高；受操作手法等因素影响，可能漏液，造成规模化制备方法效果无法保障；厂房所用空间更大，相同体积的收获液，相较于细胞工厂需要更大的空间；转瓶的清洗和灭菌需要大量劳动力，收换液等操作自动化替代难度较大。克服上述缺陷对进一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量十分重要。
技术实现思路
[0006]为解决现有腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法存在的问题，本专利技术提供了一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，所述规模化制备方法包括如下步骤：细胞制备：制备鸡胚成纤维细胞悬液；病毒接种：将腮腺炎病毒接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；细胞换液：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；病毒收获：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持
液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液；所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液；所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5
×
106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞换液步骤为：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一次收获步骤为：第二次培养66~80h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第三次培养。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述第二次收获步骤为：第三次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第四次培养。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述第三次收获步骤为：第四次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第五次培养。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述第四次收获步骤为：第五次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获和第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液。
[0020]本专利技术还提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤一：使用上述规模化制备方法对腮腺炎病毒减毒株进行规模化制备，得到病毒收获液；步骤二；对病毒收获液进行分离纯化，得到腮腺炎减毒活疫苗。
[0021]本专利技术还提供了上述规模化制备方法在制备腮腺炎病毒疫苗中的应用。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒疫苗为腮腺炎减毒活疫苗。
[0023]本专利技术技术方案，具有如下优点：本专利技术提供了一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，所述规本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于腮腺炎病毒的规模化制备方法，其特征在于，所述规模化制备方法包括如下步骤：细胞制备：制备鸡胚成纤维细胞悬液；病毒接种：将腮腺炎病毒接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；细胞换液：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；病毒收获：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液；所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得病毒收获液；所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。4.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。5.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5
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106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。7.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病...
【专利技术属性】
技术研发人员：安祺，田大勇，张亚静，张楠，
申请(专利权)人：北京赛尔富森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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