富集病毒的微马达的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了富集病毒的微马达的制备方法及其应用。本发明专利技术所提供的富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：(1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；(2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；(3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；(4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微马达。本发明专利技术制备得到的微马达上可携带生物素化的抗体并进行病毒的特异性富集。体并进行病毒的特异性富集。体并进行病毒的特异性富集。

【技术实现步骤摘要】
富集病毒的微马达的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒富集
，特别地涉及富集病毒的微马达的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]新冠肺炎在2020年成为了危害全球的超级病毒，严重影响各国人民的健康和各个国家的经济发展，研发出快速准确的新冠肺炎病毒检测方法就显得更为重要。目前，新冠病毒检测的方法主要通过咽试纸进行上呼吸道病毒检测，为提高检测速率，实现大规模检测，需要将多个样本合并检测。因此，提高病毒的富集效率对于样本检测的准确率尤为重要。
[0003]目前富集病毒的方法有聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)沉淀法、超速离心法、超滤法和免疫磁珠分离法。
[0004]基于PEG可在中性高离子强度的缓冲液中使病毒沉淀的原理，PEG沉淀法被广泛用于从洗脱液中富集病毒。PEG沉淀法操作简单，只需将洗脱液的pH调至中性，并提高其离子强度，加入PEG后于4℃静置过夜，即可将病毒沉淀。PEG沉淀法成本低廉、易于操作，已被广泛用于从洗脱液中沉淀病毒，但是一般需要沉降，耗费时间较长，而且需要高速离心机等大型设备。
[0005]超速离心法浓缩病毒是通过60,000r/min以上的转速来获得约为重力加速度50万倍的离心力，从而达到浓缩病毒的目的。其原理是利用每个颗粒都有不同的质量、密度、大小及形状等，使其在条件相同的离心场中有不同的沉降速度，由此便可以实现物质之间的分离，达到浓缩效果。超速离心机价格较高，而且要求样品的体积很小，一般用作二次浓缩。
[0006]免疫磁珠分离法的原理是利用抗体和抗原特异性结合，把抗体包裹在磁珠表面，并将其装填成柱，水样通过柱子与其中的免疫磁珠充分接触后，最后再用洗脱液洗脱病毒，这样就可以分离出被检测病毒。使用磁珠法由于需要被动的磁棒多次搅动来驱动磁珠，提高富集效率，因而很难实现设备小型化。

技术实现思路

[0007]为了弥补以上领域的不足，本专利技术的主要目的是提供一种富集病毒的微马达的制备方法。
[0008]本专利技术所提供的富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；
[0010](2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；
[0011](3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；
[0012](4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微
马达。
[0013]进一步，在所述步骤(4)得到微马达后，还包括用1H,1H,2H,2H
‑
全氟
‑1‑
辛醇和无水乙醇的混合溶液超声清洗所述微马达的步骤。
[0014]优选地，所述混合溶液中1H,1H,2H,2H
‑
全氟
‑1‑
辛醇的质量百分比浓度为50％；无水乙醇的质量百分比浓度为50％。
[0015]使用质量百分比浓度为50％1H,1H,2H,2H
‑
全氟
‑1‑
辛醇和50％无水乙醇的混合溶液可以有效的将上述混合溶液中的biorad生成油和未参与反应的戊二醛萃取出来，从而实现微马达的清洗。
[0016]进一步，在所述步骤(4)得到微马达后，还包括在所述微马达上修饰生物素化的赖氨酸聚合物的步骤。
[0017]所述步骤(2)的Fe3O4@Ag纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
[0018]向AgNO3中滴加氨水，使溶液先浑浊后变清，得到银氨溶液；
[0019]将Fe3O4纳米粒子加入水中制备Fe3O4纳米粒子分散液，并加入所述银氨溶液中，超声处理，得到混合物；
[0020]将含葡萄糖的水溶液加入所述混合物中，搅拌，即得到Fe3O4@Ag纳米粒子。
[0021]制备Fe3O4@Ag纳米粒子是因为其具备Ag对H2O2的催化特性，同时又具备Fe3O4的磁性。
[0022]所述混合溶液A中所述羧甲基壳聚糖的质量百分比浓度为2％；所述海藻酸钠的质量百分比浓度为2％。
[0023]所述混合溶液A与所述Fe3O4@Ag纳米粒子的比例为：每2mL混合溶液A加入3mg Fe3O4@Ag纳米粒子。
[0024]所述步骤(3)中的所述水相和所述油相通过注射泵注入所述T形微流控芯片中，注入速度分别为0.7μL/min和10μL/min。
[0025]所述方法制备得到的富集病毒的微马达也属于本专利技术的保护范围。
[0026]本专利技术还提供一种富集病毒的方法。
[0027]本专利技术所提供的富集病毒的方法，包括如下步骤：
[0028]向所述的微马达中加入PBS缓冲液，得到微马达的PBS分散液；
[0029]在容器中加入病毒悬液、T
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X100表面活性剂和H2O2，混匀后，加入所述微马达的PBS分散液，静置，让所述微马达自由捕获病毒。
[0030]所述微马达的PBS分散液中所述微马达的浓度为0.5mg/ml；
[0031]所述表面活性剂曲拉通X
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100(T
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X100)的质量分数为：0.5～2.5％；
[0032]优选地，所述表面活性剂曲拉通X
‑
100的质量分数为：1％；
[0033]所述H2O2的质量分数为：1～10％；
[0034]所述静置的时间为5～30分钟；
[0035]优选地，所述静置的时间为5分钟。
[0036]本专利技术通过直接在粒子上修饰抗体，可对病毒进行特异性识别并富集。粒子的制备采用微流控技术，通过油包水的方式在T形微流控芯片中生成液滴，再进行化学交联。通过静电吸附和特异性识别，在所制备的粒子表面进行逐层修饰，最终修饰上大量的抗体。
[0037]本专利技术首次使用微马达进行病毒的富集，微马达上可携带任何生物素化的抗体并
进行病毒的特异性富集。
[0038]通过富集可有效提高后续PCR检测的灵敏度，避免混检导致样本稀释浓度过低而产生的假阴性现象。
附图说明
[0039]为了说明而非限制的目的，现在将根据本专利技术的优选实施例、特别是参考附图来描述本专利技术，其中：
[0040]图1为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达在不同双氧水浓度下病毒的富集程度。
[0041]图2为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达对不同浓度病毒的富集效率。
[0042]图3为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达不同富集时间对相同浓度病毒的富集效率。
[0043]图4为CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达测试假阴性样本的灵敏度检测结果。
[0044]图5为利用透射电子显微镜对Fe3O4@Ag纳米粒子的表面形貌表征结果，及通过能谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：(1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；(2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；(3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；(4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微马达。2.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)得到微马达后，还包括用1H,1H,2H,2H
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全氟
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辛醇和无水乙醇的混合溶液溶液超声清洗所述微马达的步骤。3.根据权利要求1或2所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)得到微马达后，还包括在所述微马达上修饰生物素化的赖氨酸聚合物的步骤。4.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的Fe3O4@Ag纳米粒子的制备方法包括如下步骤：向AgNO3中滴加氨水，使溶液先浑浊后变清，得到银氨溶液；将Fe3O4纳米粒子加入水中制备Fe3O4纳米粒子分散液，并加入所述银氨溶液中，超声处理，得到混合物；将含葡萄糖的水溶液加入所述混合物中，搅拌，...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔海鹏，庞慰，段学欣，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：