一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽制造技术

本发明专利技术提供一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液即为本发明专利技术所提供的多肽溶液。本发明专利技术所提供的多肽来源于鱼加工下脚料，可以合理利用生物资源，减少浪费和环境污染，同时酶解法制备的多肽成本较低，营养价值高且安全易于吸收，可用于制备用于促进细胞增殖、生长的制品，如促细胞增殖的药品、食品、保健品或是作为原料来制备饲料。作为原料来制备饲料。作为原料来制备饲料。

【技术实现步骤摘要】
一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽


[0001]本专利技术属于水产品加工
，具体涉及一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽。

技术介绍

[0002]我国具有丰富的渔业资源，水产品是深受消费者喜爱且具有较高营养价值的饮食佳品之一。在鱼类加工过程中会产生大量的副产物，又被称为下脚料，包括鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼内脏等，这些副产物并没有得到充分利用，若直接丢弃，既浪费了大量的生物资源，又污染了环境。鱼内脏作为鱼类副产物蛋白质含量非常高，含有人体必需的氨基酸，是制备天然蛋白质的优秀原料，既可物以致用，又能避免浪费。
[0003]多肽因其优越的生物相容性、易吸收、安全、水溶性好、低分子量等优点，同时具有保护、修复损伤细胞、促进细胞生长功效，因此多肽作为促细胞增殖物质具有巨大的发展潜力。
[0004]多肽通过化学合成法制备，虽然功能明确有效，但无营养价值，而且合成过程繁琐，产率低，成本很高，只适合于合成短肽。蛋白酶酶解法相对简单、廉价，制备的多肽氨基酸种类丰富，保留了蛋白质的营养价值且易于吸收。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，从而提高鱼下脚料的加工价值。
[0006]本专利技术所提供的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液即为本专利技术所提供的多肽溶液；
[0007]所述的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，作为实施例的一种具体记载，其酶活比为2:1；
[0008]所述的酶解，其一种具体条件是在50℃酶解3
‑
5h；
[0009]所述的多肽，将制备的多肽溶液经过C18色谱柱后，再使用50％甲醇洗脱得到的多肽；
[0010]更进一步的，所述的多肽的，其中具体多肽的序列如下：
[0011]QQGQPQAQPQPQ(SEQ ID NO:1)、
[0012]SGYSSGGGYSSGGGFSGGSSGGY(SEQ ID NO:2)、AGGGGGRAGGGDLGIG(SEQ ID NO:3)、AGDTHLGGEDFDNR(SEQ ID NO:4)。
[0013]本专利技术所提供的多肽来源于鱼加工下脚料，可以合理利用生物资源，减少浪费和环境污染，同时酶解法制备的多肽成本较低，营养价值高且安全易于吸收，可用于制备用于促进细胞增殖、生长的制品，如促细胞增殖的药品、食品、保健品或是作为原料来制备饲料。
附图说明
[0014]图1：多肽分子量的标准曲线图；
[0015]图2：鱼下脚料多肽的分子量分布图；
[0016]图3：粗分离的不同组分的多肽对细胞增殖率的影响图；
[0017]图4：粗分离的多肽的不同活性部位多肽对养殖鱼增重率的影响图；
[0018]图5：粗分离的多肽的不同活性部位多肽对养殖虾增重率的影响图；
[0019]图6：精制活性部位多肽对细胞增殖率的影响图；
[0020]图7：EGFR与多肽分子对接结构图；
[0021]图8：合成多肽对细胞增殖率的影响图。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。
[0023]实施例1：制备多肽
[0024]1、鱼下脚料多肽的制备
[0025]将鱼下脚料用高速剪切机匀浆后，煮沸10min，匀浆液冷却至45
‑
55℃后，按照干重3％的比例加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶(酶活比为2:1)，搅拌均匀，50℃酶解3
‑
5h，酶解结束后，12000rpm离心，收集上清液，上清液利用10kDa的膜进行过滤，过滤液利用360Da的膜过滤，得到分子量在360Da
‑
10kDa区间的多肽液，多肽液经真空减压干燥，得到多肽固体，经粉碎机粉碎，过80目筛网，得到鱼下脚料多肽粉末FBP(Fish byproduct peptide)。
[0026]2、鱼下脚料多肽分子量分布测定
[0027]采用HPLC法测定鱼下脚料多肽分子量分布状况，配制浓度为5.0mg/mL的标准品甘氨酰肌氨酸(146Da)、甘氨酰甘氨酰酪氨酰
‑
精氨酸(451Da)、杆菌肽(1422Da)、抑肽酶(6511Da)、细胞色素C(12327Da)以及鱼下脚料混合肽溶液，经0.22μm膜过滤，待用。色谱条件为TSK gel G2000 SWXL柱(7.8mm
×
300mm)，柱温30℃，进样量10μL，进样次数3次，流速1.0ml/min。流动相为含45％乙腈和0.1％三氟乙酸的超纯水溶液，采用等梯度洗脱，洗脱时间为20min，于214nm处测吸光度，以标准品分子量对数lg MW为纵坐标，保留时间t为横坐标建立标准曲线(图1)，采用手动积分的方式测定鱼下脚料多肽分子量分布比例。
[0028]通过公式计算：粗多肽得率/％＝提取物的质量/原料的质量
×
100％，得到FBP的得率为38.91％。通过凯氏定氮法测得含氮量为9.32％，其蛋白质含量为58.25％。
[0029]如图2所示，制备的FBP多肽粉末中360～1000Da的多肽占比最高，高达73.21％，1～5KDa的多肽占比为18.74％，5～10KDa的多肽占比为8.05％。
[0030]实施例2：多肽的粗制分离及组分效果分析
[0031]取实施例制备的鱼下脚料多肽粉末10g，溶于100mL纯水中，配成100mg/mL多肽溶液。利用制备液相色谱(Dubhe C18制备柱(250
×
20mm，10μm)，流速8mL/min，进样量1mL、100mg/mL，柱温为室温，检测波长220nm)对鱼下脚料多肽进行分离，分别收集5％甲醇洗脱部分作为F1，25％甲醇洗脱部分作为F2，50％甲醇洗脱部分作为F3，80％甲醇洗脱部分作为F4。收集的不同部分的产物烘干后进行成分分析和活性检测。
[0032]通过细胞增殖实验和水产动物养殖来筛选检测活性高的组分。
[0033]1、细胞增殖实验
[0034]将小鼠前成骨细胞系MC3T3
‑
E1细胞以2
×
104个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板中，恒温培养24h后移去原培养基，随后分别将活性部位F1
‑
F4配制系列浓度梯度的多肽溶液(0.1、0.5、2.0、3.0mg/mL)，以每孔200μL加入96孔板中，在温度为37℃，CO2和空气浓度分别为5％和95％的恒温培养箱中连续培养48h，空白组加入等体积培养基，MTT法测增殖率。
[0035]相对增殖率计算％＝A
样品
/A
空白
×
100％
[0036]式中：A
样品
为样品溶液的吸光度；A
空白...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从鱼下脚料中制备的具有促增殖功能的多肽，其特征在于，所述的多肽，是将鱼下脚料进行蒸煮后，匀浆液用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解；酶解液离心后，上清先用分子量不超过10kDa的膜进行过滤，过滤液再利用分子量不大于360Da的膜过滤，截留液制备的多肽溶液。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活比为2:1。3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的酶解，是在50℃酶解3
‑
5h。4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽溶液经过C18色谱柱后，再使用50％甲醇洗脱。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑娴，叶海斌，樊英，刁菁，盖春蕾，许拉，王友红，王晓璐，于晓清，魏鉴腾，
申请(专利权)人：山东省海洋科学研究院青岛国家海洋科学研究中心，
类型：发明
国别省市：