本发明专利技术涉及一种定向选育解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）耐高温变异菌株的选育方法，可显著提高菌种的极限耐受温度，并将该方法用于赤藓糖醇发酵菌种的改造，得到解脂亚罗酵母GDMCC 61939，使菌株最适发酵温度从原种的29℃提高到34℃以上，从而降低发酵过程中的冷却负荷，具有显著的应用价值。具有显著的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种耐高温解脂亚罗酵母变异菌株的选育方法及其在赤藓糖醇发酵中的应用
[0001]本专利技术涉及工业微生物的改造和应用，属于生物工程
技术介绍
[0002]解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）是一种典型的中温好氧酵母菌种。由于其安全、易培养及可利用碳源等特点，目前被广泛的用于脂肪酶、有机酸等产物的生产并被广泛用作基因工程宿主菌用于外源基因的表达。然而解脂亚罗酵母的生长温度限制却非常严格，几乎所有的野生品系的极限耐受温度仅能达到32℃，这一性质很大程度上限制了其在一些场合的应用，尤其是在高细胞密度、大容积发酵的场合，由于系统的大量放热升温会造成生长迟滞、产品产量降低甚至酵母细胞死亡。随着全球环境温度的不断升高和不断收紧的碳排放要求，发酵系统的控温所需的降温成本将日益升高，因此提高解脂亚罗酵母菌种的温度耐受性具有紧迫性的实用性。近年来，众多的研究表明高热量的食糖摄入会对健康带来诸多不利影响，而食用低热量甜味剂成为满足人们对甜味需求的重要途径，并为食品、饮料生产企业和广大消费者所普遍接受。在低热量甜味剂中糖醇类化合物，其中的赤藓糖醇是所谓的填充型、零热量甜味剂的最突出的代表，由于其具有良好的甜感和生物耐受性而备受业界的重视，具有良好的市场容量和发展前景。目前，可用于赤藓糖醇生产的菌种中解脂亚罗酵母是唯一的被国际公认安全（GRAS）的菌种，对该菌种的赤藓糖醇发酵过程研究和改造受到了普遍的重视，而提高赤藓糖醇的高温耐受性的研究也是其生物工艺学研究的重要领域。目前，获得解脂亚罗酵母高温耐受菌株的方法主要包括酵母菌种逆境驯化育种法和基因工程两种方法。前者是通过长期不断反复提高菌种的培养温度，从中选择具有耐高温表观性状的变异株的方法，这种选育方法的筛选周期长，而且获得耐高温性状的稳定性差、菌种性能退化快，对酵母菌这类多倍体真菌这些缺点也更加突出。后者是利用从外源基因供体生物中获取的耐高温基因，如编码热休克蛋白HSP的基因，将其整合到解脂亚罗酵母的基因组中，使其具有一定的耐高温性能。但是这种方法的转化成功率低，对菌种的生产性状的影响可能较大，还需要进行全局性的细胞生物学优化才能获得可供工业应用的良好菌株。而且目前在很多国家和地区，利用基因工程方法获得的工程菌在食品及其配料中的应用收到很大的法规和伦理学方面的限制。因此需要其他有效的方法来获得温度耐受性更高的途径。前期研究表明，微生物的耐热性很大程度上取决于氧化应激 (ROS) 压力是导致的细胞结构的破坏，酵母细胞在有氧条件下的ROS主要由线粒体细胞器的氧化呼吸链产生，因此降低呼吸链的反应强度可以有效的减少其产生，从而减少对细胞膜系等活性元件的破坏。而在线粒体等亚细胞元件中发挥作用的蛋白，大多是由染色体基因组所编码并在细胞质中合成后转运到细胞器中的，其决定蛋白质定位的信号肽对于同工酶在细胞中的定位发挥了重要的作用。而对于解脂亚罗酵母的信号肽的序列中包含了很高比例的碱性氨基酸，
如精氨酸和赖氨酸的残基，因此有望通过减少酵母细胞的碱性氨基酸的合成和供应来降低线粒体的氧化活性，从而提高菌种的温度适应性。本专利技术通过从经理化方法诱变得到的酵母突变表型库中筛选碱性氨基酸缺陷标记，从中高效筛选出具有耐高温性状的稳定突变株，并将该方法用于赤藓糖醇生产酵母菌种的选育获得可在高温下发酵的菌种。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供一种适于解脂亚罗酵母耐高温性状筛选的方法，并利用该方法选育适合赤藓糖醇发酵的新菌株，以提高菌种的温度耐受性，减少用于发酵过程降温负荷，以降低生产成本。 菌株保藏信息：菌种名称：Yarrowia lipolytica R27，保藏编号：GDMCC NO:61939，保藏日期：2021年9月16日，保藏地点：广东省微生物菌种保藏中心，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0009]一、本专利技术的解脂亚罗酵母菌种改造技术，是以普通的野生型的解脂亚罗酵母CGMCC No.1431为出发株，经过理化、分子生物学方法使其发生遗传变异，其中涉及各种表型变异。从中筛选出其中的精氨酸营养缺陷株，然后可以从中悬着具有稳定高温耐受性的变异株。
[0010]进一步的，该操作按如下步骤进行：(1) 利用EMS、UV等化学及物理诱变方法和其他分子诱变方法处理解脂亚罗酵母细胞，获得酵母变异文库。
[0011](2)筛选在常温下只在完全培养基上生长而不在不含精氨酸的YNB为氮源的合成培养基上生长的精氨酸营养缺陷型变异株。
[0012](3)验证对照出发菌株和精氨酸营养缺陷株的高温耐受性差异，从中挑选出耐高温的变异株。
[0013]二、利用本专利技术的解脂亚罗酵母进行赤藓糖醇的生产的方法，其特征包括筛选耐高温的精氨酸营养缺陷型菌种，然后进行利用葡萄糖的赤藓糖醇发酵。
[0014]进一步，具体步骤如下：(1)菌种活化将变异株在含精氨酸的YNB固体培养基平板上划线，34
±
1℃培养72小时。
[0015](2) 种子培养无菌条件下，挑取步骤(1)平板上的单菌落，接种发酵培养基，34
±
1℃摇床培养24小时，获得种子液。
[0016] (3) 发酵培养将种子液以0.1
ꢀ–ꢀ
20%接种量接种到发酵培养基中，30
±
1℃摇床培养12
±
2小时，获得发酵液。
[0017]其中，上述步骤(1)中所述培养基配方为：1 L水中加入精氨酸100mg，葡萄糖100g，琼脂20g，115℃灭菌30分钟。待培养基未冷却时，用除菌微孔过滤器过滤10x的不含氨基酸的YNB溶液到培养基中使得最后加量为6.7g。
[0018]上述步骤(2)中所述种子培养基配方为：1L水中加入酵母浸粉3g，蛋白胨5g，葡萄糖100g，115℃灭菌30分钟。
[0019]上述步骤(3)中所述发酵培养基配方为：1L水中加入酵母浸粉3g，蛋白胨5g，葡萄糖300g，115℃灭菌30分钟。
[0020] (4)发酵过程葡萄糖和赤藓糖醇检测方法将发酵液稀释并经0.22μm滤膜过滤后，采用HPLC的方式检测过滤液中葡萄糖和赤藓糖醇的含量。色谱条件如下：检测器，示差检测器；色谱柱，钙型强阳离子交换柱；柱温，80℃；流动相，重蒸水；流速，0.7mL/min；进样体积，10μL。
[0021]本专利技术成功实现了从精氨酸缺陷型的解脂亚罗酵母的突变株中高效率的筛选出具有较高温度耐受性的赤藓糖醇高产菌株，具有筛选速度快，耐高温性状稳定且简便高效等特点。
[0022]本专利技术具有的突出特点是：（1）本专利技术提供了利用精氨酸营养缺陷表型为辅助标记从野生解脂亚罗酵母变异株中筛选耐高温变异株的方法，变异株的筛选效率和耐高温性状的稳定性比普通的筛选方法有显著提高。
[0023]（2）利用上述方法获得的耐高温赤藓糖醇发酵菌种的温度适应范围可扩展到34~35℃，可以显著降低赤藓糖醇发酵过程的冷却成本。赤藓糖醇的转化率可达到63%以上。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用精氨酸营养缺陷作为指示标记筛选耐高温解脂亚罗酵母变异菌株的选育方法。2.权利要求1所述的选育方法，其特征在于利用自然突变或物理、化学诱变方法获得精氨酸的营养缺陷株，然后从中挑选出具有在35℃以上温度生长的酵母变异菌株。3.如权力要求1所述的耐高温解脂亚罗酵母变异菌株，其特征在于该菌株寄存于广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC 61939。4.权利要求1所述选育方法应用于发酵制备赤藓糖醇，具体方法为，使用权利要求3所述菌株，在34~35℃下利用葡萄糖为碳源发酵生产赤藓糖醇，进一步包括如下步骤：(1) 将权利要求3所述菌株采用如下培养基制备种子液：葡萄糖5
‑
20%（w/v），酵母浸出物0.03
‑
2.5%（...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴疆森，李红娇，董建辉，郝飞克，栾春光，金玮鋆，于佳俊，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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