一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法技术

本发明专利技术公开了一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法。该方法包括以下步骤：(1)将醇化烟叶与磷酸缓冲液、石英砂和玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液；(2)过滤步骤(1)获得的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于第一容器中，把微孔滤膜固定在所述第一容器的口，将所述第一容器倒置于第二容器中，即获得分离的微生物；将步骤(2)中的微孔滤膜收集于第三容器中，加入钢珠和磷酸缓冲液，振荡、洗脱并离心，即获得富集的微生物。该方法快速、高效，且尤其适用于醇化烟叶的表面微生物分离和富集。并且，该方法能够尽可能完整地保持微生物群落的物种多样性。完整地保持微生物群落的物种多样性。完整地保持微生物群落的物种多样性。

【技术实现步骤摘要】
一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法


[0001]本申请属于生物
，具体涉及一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法。

技术介绍

[0002]烟叶醇化是烟草加工过程中改善烟叶品质的一个重要环节。烟叶醇化机理主要包括酶作用、微生物作用和化学作用3个方面。其中，微生物作用贯穿于烟叶发酵和醇化的整个过程，微生物可利用烟叶中的有机成分，特别是淀粉、果胶、蛋白质、纤维素和木质素等大分子物质，通过某些代谢途径最终将有机大分子成分转化为小分子物质，进而改善烟叶风味和品质。因此，有很多研究者致力于这些可降解有机大分子物质的微生物的分离和应用研究。
[0003]烟叶醇化过程中，微生物菌群所具有的与品质相关的功能基因在大分子有机物质降解和转化过程中起着非常重要的作用，是影响烟叶品质的关键因素之一。挖掘和利用微生物基因资源，通过发酵获得生物酶制剂，专一性地催化降解淀粉、果胶、蛋白质、纤维素和木质素等大分子物质，是提高低次烟叶吸食品质的一种重要途径。采用传统的纯培养方法是当前微生物研究的主要思路，获得微生物活体并进行培养后才能开展后续的利用研究，开发微生物产品。但是，自然界中99％以上的微生物处于不可培养或未培养状态，现阶段所开展的微生物分离培养获得的菌株种类和数量较少，严重阻碍了微生物资源的充分利用。宏基因组技术克服了传统培养法的缺陷，可直接提取环境样本中的DNA进行测序，并准确获得样品微生物物种信息，拓宽了功能性微生物筛选的面，使得大量不可培养的微生物基因资源得以充分利用，为寻找新基因、挖掘和利用更多的微生物资源提供了便利的工具。目前，该技术已运用于土壤中微生物酶的发酵及次级代谢产物抗菌物质的获得等方面的研究，但对于烟叶中微生物资源利用的研究甚少。
[0004]从醇化烟叶中尽可能完整地分离与富集微生物是进行宏基因组测序的前提，也是全面认识醇化烟叶微生物群落的结构和功能的基础。然而，由于醇化烟叶表面的微生物数量相对较少，大大增大了微生物洗脱的难度和效率。因此，提高醇化烟叶表面微生物的分离和富集效率是目前研究亟需解决的问题。这就需要一种适用于醇化烟叶的快速、有效洗脱和分离微生物的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服醇化烟叶微生物难洗脱、难分离的问题，提供一种快速、高效、适用于醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，尽可能完整地保持微生物群落的物种多样性。为解决上述技术问题，本专利技术提出的醇化烟叶表面微生物的分离和富集方案为：
[0006](1)醇化烟叶表面微生物的洗脱：将15～18g的醇化烟叶置于1L无菌锥形瓶中，加入350～380mL灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，控制烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:1～5:1～3。以200rpm的转速在15℃低温摇床中震荡振荡1.5h，得到烟叶表面
微生物洗脱液；
[0007](2)微生物菌体的富集：将无菌操作台紫外灭菌20min后，在操作台中，用橡皮筋将孔径30～120μm的无菌纱布固定在步骤(1)中装有微生物洗脱液的瓶口，将洗脱液过滤至无菌烧杯中，然后倒入无菌细口塑料瓶中。用10cm
×
3cm的PARAFILM封口膜固定直径为50mm、孔径为0.22μm的无菌水系微孔滤膜于塑料瓶瓶口，并将塑料瓶倒置于瓶口直径为60mm的广口三角瓶中。使用酒精灯烧过的剪刀在塑料瓶液体上方5～6cm处打一个小孔，在无菌操作台中倒置过夜，微生物便富集到滤膜上。所使用的细口塑料瓶瓶身光滑，瓶身高为16cm，瓶底部长为10cm，宽为7.5cm，容量刻度为1L，瓶口直径为35mm。
[0008](3)微生物菌体的纯化：使用无菌镊子将步骤(2)中滤膜收集于15mL无菌离心管中，加入3～4颗直径为3mm的无菌钢珠和5mL无菌磷酸盐缓冲液，置于SI漩涡混合仪上，将滤膜上的微生物进行振荡15min。洗脱后，用无菌镊子将滤膜取出，将微生物悬浮液转移至无菌1.5mL离心管中，先以2000rpm的速度离心2min，除去大分子杂质，转移上清至新的离心管中，再以12000rpm的速度离心3min，倒掉上清，收集微生物沉淀。
[0009]本专利技术方法对醇化烟叶微生物进行过滤富集和洗涤纯化，步骤简单，容易操作，富集效率高，适用于醇化烟叶微生物的富集和纯化。
[0010]术语解释：
[0011]本专利技术中，如无特别说明，“醇化烟叶”是指经烟叶采收、烘烤、复烤后，为了去掉烟叶的青杂味和改善香吃味等品质，对烟叶进行的改善操作于一定的环境条件下储存一段时间所得到的烟叶。醇化烟叶的醇化可以通过人工醇化方式和自然醇化两种方式中的一种方式来进行方式。
[0012]本专利技术中，如无特别说明，“微生物”是指包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体。它们个体微小，与人类关系密切，涵盖了有益跟有害的众多种类。微生物共划分为8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝、香菇等。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”。
[0013]在第一方面，本申请提供了一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，所述方法包括：
[0014](1)将醇化烟叶与磷酸缓冲液、石英砂和玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液；
[0015](2)过滤步骤(1)获得的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于第一容器中，把微孔滤膜固定在所述第一容器的口，将所述第一容器倒置于第二容器中，即获得分离的微生物；
[0016]任选地，将步骤(2)中的微孔滤膜收集于第三容器中，加入钢珠和磷酸缓冲液，振荡、洗脱并离心，即获得富集的微生物。
[0017]如前所述的方法，所述方法包括：
[0018](1)将醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液；
[0019](2)使用纱布过滤步骤(1)中所得到的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于无菌细口塑料瓶中，把微孔滤膜固定在瓶口，将塑料瓶倒置于广口三角瓶中，过夜，微生物富集
到滤膜上，即获得分离的微生物；
[0020](3)将步骤(2)中滤膜收集于15mL无菌离心管中，加入无菌钢珠和灭菌的磷酸缓冲液，置于振荡器上，将滤膜上的微生物进行振荡洗脱后，离心，收集微生物沉淀，即获得富集的微生物。
[0021]如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述醇化烟叶的质量为15～18g。
[0022]如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液包含137mmol/L NaCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，并且所述磷酸缓冲液的pH为7.4。
[0023]如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15～18g醇化烟叶中加入300～400mL磷酸缓冲液。在某些实施方案中，所述所述磷酸缓冲液的加入量为每15～18g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，所述方法包括：(1)将醇化烟叶与磷酸缓冲液、石英砂和玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液；(2)过滤步骤(1)获得的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于第一容器中，把微孔滤膜固定在所述第一容器的口，将所述第一容器倒置于第二容器中，即获得分离的微生物；任选地，将步骤(2)中的微孔滤膜收集于第三容器中，加入钢珠和磷酸缓冲液，振荡、洗脱并离心，即获得富集的微生物。2.权利要求1的方法，所述方法包括：(1)将醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液；(2)使用纱布过滤步骤(1)中所得到的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于无菌细口塑料瓶中，把微孔滤膜固定在瓶口，将塑料瓶倒置于广口三角瓶中，过夜，微生物富集到滤膜上，即获得分离的微生物；(3)将步骤(2)中滤膜收集于15mL无菌离心管中，加入无菌钢珠和灭菌的磷酸缓冲液，置于振荡器上，将滤膜上的微生物进行振荡洗脱后，离心，收集微生物沉淀，即获得富集的微生物。3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述醇化烟叶的质量为15
‑
18g。4.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15
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18g醇化烟叶中加入300
‑
400mL磷酸缓冲液。5.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15
‑
18g醇化烟叶中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈善义，陈千思，李菁菁，陶界锰，何伟，姜振锟，龙腾，陈义强，曹培健，卢鹏，
申请(专利权)人：福建中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：