【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物筛选领域，具体涉及一种可降解烟叶大分子物质的微生物的筛选方法。
技术介绍
1、在烟叶醇化过程中，其内源酶会降解细胞，也包括降解细胞壁和细胞器中的大分子物质，若烟叶醇化不完全，其大分子物质含量过高，则烟叶燃烧性差、杂气重、一氧化碳和焦油量增加，进而带来不愉悦的感官体验。但烟叶在醇化过程中，很难做到每一片烟叶都醇化得恰到好处，因此需要额外的大分子物质降解酶来辅助醇化。
2、这些大分子物质降解酶可从烟叶表面的微生物中提取，因此需要做菌种筛选工作。当前高产大分子物质降解酶的菌株筛选只是简单地从烟叶表面提取微生物或用常规的固体培养基进行初筛、常规的液体培养基进行复筛，筛菌工作量和盲目性较大。因此需要重新构建一套深度融合感官评吸和烟叶加工生产实际的大分子物质降解菌的筛菌方法。
技术实现思路
1、微生物筛选
2、在一个方面，本专利技术提供一种微生物筛选方法，其包括以下步骤：
3、(1)基于物质含量对烟叶感官影响，对烟叶进行感官评价，筛选获得目标烟叶；其中，对所述目标烟叶的感官评价结果为弱感知或无法感知所述物质；
4、(2)收集步骤(1)所得目标烟叶表面的微生物；
5、(3)将步骤(2)所得微生物在扩增培养基中进行扩增培养；
6、(4)检测步骤(3)扩增后的微生物对所述物质的降解；
7、(5)基于步骤(4)的检测结果，筛选所述微生物。
8、在一些实施方案中，所述物质为蛋白质和/或多糖
9、在一些实施方案中，在步骤(1)前，还包括建立物质含量对烟叶感官影响评价标准的步骤。
10、在一些实施方案中，所述建立物质含量对烟叶感官影响评价标准的步骤包括：
11、检测多个烟叶样品中所述物质的含量；
12、按照所述物质的含量，对所述烟叶样品进行分组；
13、对各组烟叶样品进行感官评价，以关联所述物质的含量和相应烟叶的感官感受。
14、在一些实施方案中，所述建立物质含量对烟叶感官影响评价标准的步骤包括：
15、检测多个烟叶样品中淀粉、蛋白质、果胶、纤维素和/或木质素的含量；
16、分别按照淀粉、蛋白质、果胶、纤维素或木质素的含量，将所述烟叶样品分为高含量组、中含量组和低含量组；
17、对所述各高含量组、中含量组和低含量组分别进行感官评价，以关联淀粉、蛋白质、果胶、纤维素或木质素的含量和相应烟叶的感官感受。
18、在一些实施方案中，高含量组感官评价为对淀粉、蛋白质、果胶、纤维素或木质素感受强烈；中含量组感官评价为对淀粉、蛋白质、果胶、纤维素或木质素有感觉，但不强烈；低含量组感官评价为对淀粉、蛋白质、果胶、纤维素或木质素弱感知或无法感知。
19、在一些具体实施方案中，所述建立物质含量对烟叶感官影响评价标准的步骤包括：任意选取10份上部烟叶样品、10份中部烟叶样品和10份下部烟叶样品，使用烟草行业标准yc/t 216-2013、yc/t 249-2008、yc/t 346-2010和yc/t 347-2010测定烟叶中的淀粉、蛋白质、果胶、纤维素和木质素含量，对这些大分子物质含量用三等分法划分为高含量大分子物质烟叶、中含量大分子物质烟叶和低含量大分子物质烟叶；招募10名3年以上烟龄的感官评吸人员，给定淀粉、蛋白质、果胶、纤维素和木质素含量高低时对应的描述词和区分度词，描述词的对应关系为：淀粉对应烧糊味、蛋白质对应烧焦羽毛味、果胶对应辛辣味、纤维素对应烧纸味、木质素对应涩口，区分度词的对应关系味：高含量对应感受强烈、中含量对应有感觉但不强烈、低含量对应弱感知或无法感知，将上述30份烟叶样品进行制丝和打烟，取其中20份烟叶样品作为标准样品，告知感官品吸人员大分子物质含量的测定值及其高中低含量分类结果，根据描述词和区分度词进行感知训练，在所训练的20份烟叶样品中盲选5份样品进行训练结果测试，猜测其大分子物质含量的高中低水平，以答对4份或5份样品为合格，当合格人数≥6人时，选择合格人员进行大分子物质含量与感官品吸之间的关联性测试；关联性测试的过程为：给每位训练合格的感官品吸人员抽吸之前未品过的10个烟叶样品，以正确率作为大分子物质含量与感官品吸之间的关联度，平均合格率≥80％则视为感官评吸方法构建成功。
20、在一些实施方案中，步骤(2)所述收集包括以下操作：将所述目标烟叶在pbs缓冲液中浸泡，过滤收集滤液，离心收集沉淀，获得所述微生物。
21、在一些实施方案中，在震荡条件下进行所述浸泡；优选地，在100-300r/min(例如，100r/min、150r/min、200r/min、250r/min或300r/min)震荡2-6h(例如，2、3、4、5或6h)。
22、在一些实施方案中，将步骤(2)所得微生物在pbs缓冲液中重悬制得重悬液再进行步骤(3)。在一些实施方案中，所述重悬液的od600为0.1～1.5，例如0.5。
23、在一些具体的实施方案中，所述重悬液的制备方法为：用ph7.4、0.01m的pbs缓冲液浸没烟叶，于摇床中150r/min震荡4h，用2层纱布过滤得滤液，滤液经8000r/min离心10min获得菌体，菌体加入1ml ph7.4、0.01m的pbs缓冲液重悬，获得所述重悬液。
24、在一些实施方案中，步骤(3)所述扩增培养基通过以下方法制备得到：
25、将烟叶在水中浸泡1-10h(例如，2-5h)，破碎细胞壁(例如，超声破碎)，离心收集上清液和沉淀物，按照每5-50g(例如，5-25g，再例如5-15g，再例如10g)加1l水的比例将所述沉淀物与水混合，高温灭菌，得所述扩增培养基。
26、在一些实施方案中，用于制备所述扩增培养基的烟叶为按照权利要求2所述方法，淀粉、蛋白质、果胶、纤维素和木质素的含量均为高含量的烟叶。
27、在一些具体的实施方案中，取20g烟叶用1l蒸馏水常温泡发2h，用超声破碎机进行细胞壁破碎，超声条件为：冰浴超声，功率100w，每个超声周期工作时间5s、间歇时间10s，超声时间30min，破碎后4500r/min离心15min，收集上清液和沉淀物。
28、在一些具体的实施方案中，所述扩增培养基的配置方法为：称取高含量大分子物质烟叶的细胞壁10g，加蒸馏水1l，121℃灭菌15min。
29、在一些实施方案中，步骤(3)所述培养在下述条件下进行：按照1-25％的接种量(例如，1-15％、1-10％、1-5％、1％、5％、7％、10％、15％、20％或25％)、100-300r/min(例如，100r/min、150r/min、200r/min、250r/min或300r/min)培养4-12h(例如，4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h，优选8h)。
30、在一些实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物筛选方法，其包括以下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其中，
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)所述收集包括以下操作：将所述目标烟叶在PBS缓冲液中浸泡，过滤收集滤液，离心收集沉淀，获得所述微生物；
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述微生物能够产生降解所述物质的酶；
7.权利要求1-6任一项所述的方法筛选获得的微生物。
8.一种处理液，通过以下方法制得：
9.一种烟草原料处理方法，其包括用权利要求8所述处理液处理所述烟草原料的步骤；
10.一种烟草原料，其通过权利要求9所述的方法制备得到。
11.一种烟草制品，其由权利要求10所述的烟草原料加工制得；
【技术特征摘要】
1.一种微生物筛选方法，其包括以下步骤：
2.权利要求1所述的方法，其中，
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)所述收集包括以下操作：将所述目标烟叶在pbs缓冲液中浸泡，过滤收集滤液，离心收集沉淀，获得所述微生物；
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，
6.权利要求1-5任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：范坚强，周康熙，李菁菁，陈义强，陈善义，龙腾，何伟，姜振锟，邓小华，崔振伟，卓思楚，程成，王超超，
申请(专利权)人：福建中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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