绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提供绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术从绿色木霉(Trichoderma viride)Tv

【技术实现步骤摘要】
绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]木霉(Trichoderma spp.)是一种多功能的丝状真菌，广泛存在于土壤和植物的根围、叶围、种子、球茎等生态环境中，其生防机制几乎包括了所有可能的机制，如代谢胞外酶、产生抗生性代谢产物、诱导植物抗性、水解酶与植物的防卫反应、保护酶与植物的抗病作用、毒性蛋白和协同拮抗作用等。因此，木霉已经被制成孢子粉、发酵液等多种制剂，广泛应用于农业生产中。
[0004]随着研究的广泛和深入，抗生性代谢产物在生物防治中的作用越来越受到注重，并成为植病生防菌筛选的重要指标。自1932年Weindling发现胶霉毒素(gliotoxin)到现在，从木霉中分离到的抗生性代谢产物已超过了180种，早期的研究兴趣主要集中在植物病原菌的防治方面，近期的研究重点则是从中发现具有更广泛活性的化合物，并提高代谢物的产量。
[0005]染色质介导的调控在次级代谢产物生物合成基因簇的转录表达中起着重要作用，它通过表观遗传对组蛋白进行修饰如甲基化、组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化等改变染色质的构象，促进或抑制一些DNA与转录因子的结合，来实现激活或沉默一些基因簇的表达。在丝状真菌表观遗传修饰中，组蛋白乙酰化研究最多，人们发现染色质组蛋白的乙酰化修饰与激活基因的表达密切相关，而一些次级代谢产物生物合成基因的表达也因为染色质乙酰化的程度影响其激活或沉默。组蛋白乙酰化和去乙酰化是基因转录调控的关键机制之一。
[0006]组蛋白去乙酰化酶HDACs可以分为3个家族，第一类和第二类分别是和酵母蛋白RPD3(Reduced Potassium Dependency 3)、HDA1(Histone Deacetylase 1)同源的酶类，第三类是和玉米HD2(Histone Deacetylase 2)相关的蛋白。有研究表明通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase，hdac)显著提高了纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平。
[0007]木霉体内代谢途径丰富，代谢产物繁多，其基因转录和表达受到复杂而严格的调控。目前及今后一段时间的研究方向是利用基因重组技术及基因敲除技术创制高产木霉菌株，或利用发酵调控手段来改变其代谢流等，以提高次级代谢产物的产量，增强其生物防治效能。

技术实现思路

[0008]为了克服上述技术问题，本专利技术提供绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和
应用。本专利技术从绿色木霉(Trichoderma viride)Tv
‑
1511基因组中鉴定出一个组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3，通过在绿色木霉中敲除该编码基因构建相应工程菌发现，通过降低TvRpd3的表达，能够显著提高木霉基因组组蛋白乙酰化水平，改变了木霉菌株抗生性代谢产物种类和含量，增强了木霉菌株对多种植物病原菌的拮抗抑制能力，因此具有良好的实际应用之价值。
[0009]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因，命名为TvRpd3，所述编码基因具有(a1)
‑
(a3)中任一所述核苷酸序列：
[0011](a1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0012](a2)与(a1)互补的核苷酸序列；
[0013](a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0014]SEQ ID NO.1由2001个核苷酸组成，其中第1
‑
1998为编码序列，第1999
‑
2001位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。
[0015]本专利技术的第二个方面，提供一种绿色木霉组蛋白去乙酰化酶，其氨基酸序列为如下(b1)
‑
(b3)中任一项：
[0016](b1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0017](b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质；
[0018](b3)其它基因编码的与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.2所示的蛋白的活性的蛋白；
[0019]上述(b2)中，所述“一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0020]上述(b1)
‑
(b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0021]如上所述，本专利技术通过研究发现，通过降低TvRpd3的表达，能够显著提高木霉基因组组蛋白乙酰化水平，改变了木霉菌株抗生性代谢产物种类和含量，增强了木霉菌株对多种植物病原菌的拮抗抑制能力。
[0022]因此，本专利技术的第三个方面，提供一种木霉工程菌，所述木霉工程菌缺失上述TvRpd3基因或抑制上述TvRpd3基因的表达。
[0023]其中，所述木霉工程菌为绿色木霉工程菌。
[0024]本专利技术的第四个方面，提供上述木霉工程菌的构建方法，所述构建方法包括：通过同源重组的方法，敲除上述组蛋白乙酰化酶编码基因TvRpd3，即获得缺失组蛋白乙酰化酶编码基因TvRpd3的木霉工程菌。
[0025]具体的，所述构建方法包括如下步骤：
[0026](1)基于TvRpd3基因5
’
侧翼序列(上游)、3
’
侧侧翼序列(下游)以及抗性基因Hyg
‑
R序列设计引物，通过融合PCR的方法构建TvRpd3的敲除基因片段；
[0027](2)将构建好的敲除基因片段转入木霉原生质体；
[0028](3)利用Hyg
‑
R抗性，进行菌落PCR筛选阳性突变子。
[0029]其中，所述步骤(1)中，所述引物包括如SEQ ID NO.3
‑
8所示序列。
[0030]所述步骤(2)中，转入方法包括生物学上可接受的直接转化法(包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、PEG法)或者间接转化法(包括DNA病毒载体介导法、农杆菌介导法)；
[0031]优选的，利用PEG
‑
CaCl2法；
[0032]优选的，所述木霉为绿色木霉，进一步优选的，所述绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)Tv
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因，命名为TvRpd3，其特征在于，所述编码基因具有(a1)
‑
(a3)中任一所述核苷酸序列：(a1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(a2)与(a1)互补的核苷酸序列；(a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.一种绿色木霉组蛋白去乙酰化酶，其特征在于，其氨基酸序列为如下(b1)
‑
(b3)中任一项：(b1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质；(b3)其它基因编码的与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.2所示的蛋白的活性的蛋白。3.木霉工程菌，其特征在于，所述木霉工程菌缺失权利要求1所述TvRpd3基因或抑制所述TvRpd3基因的表达；优选的，所述木霉工程菌为绿色木霉工程菌。4.权利要求3所述木霉工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：通过同源重组的方法，敲除权利要求1所述的组蛋白乙酰化酶编码基因TvRpd3即得。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)基于TvRpd3基因5
’
侧翼序列、3
’
侧侧翼序列以及抗性基因Hyg
‑
R序列设计引物，通过融合PCR的方法构建TvRpd3的敲除基因片段；(2)将构建好的敲除基因片段转入木霉原生质体；(3)利用Hyg
‑
R抗性，进行菌落PCR筛选阳性突变子。6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李哲，张豪，郭凯，黄艳华，郑泽慧，郝永任，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：