生物体对药物的响应的微流体测量制造技术

本申请涉及生物体对药物的响应的微流体测量。本文公开了用于快速评价样品中存在的微生物是否对处理易感或耐受的方法和装置。生物是否对处理易感或耐受的方法和装置。生物是否对处理易感或耐受的方法和装置。

【技术实现步骤摘要】
生物体对药物的响应的微流体测量
[0001]本申请是申请日为2015年11月05日，申请号为201580071356.7，专利技术名称为“生物体对药物的响应的微流体测量”的申请的分案申请。
[0002]交叉引用
[0003]本申请要求于2014年11月5日提交的美国临时申请号62/075,648的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。


[0004]本申请涉及微流体领域以及生物实体的检测和扩增领域。
[0005]专利技术背景
[0006]抗生素耐受性(resistance)对全球公共健康构成主要的迫在眉睫的威胁。来自CDC(美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，2013,114)和WHO(组织(Organization)，2014,257)的统计资料令人震惊，并强调目前的自由和非选择性抗生素使用模式不能继续。对其存在有限治疗选择方案的革兰氏阴性生物体的耐受性的出现尤为令人担忧。诊所(clinics)中广谱抗生素的过度使用是药物耐受病原体进化和传播的主要贡献者；然而，对抗耐受性要求所有环境(settings)中的诊断开发。
[0007]为了改善护理，临床实验室要求鉴定病原体并确定其抗微生物剂易感性的快速测试。实验室目前经由花费24
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48小时的基于培养的方法进行鉴定和抗微生物剂易感性测试(AST)。因为医师在最接近的时间帧内不知道存在什么样的生物体、细菌负荷或生物体对各种治疗方法的易感性，所以临床医师通常选择用广谱(例如第二代和第三代)抗生素治疗，并且甚至可以治疗亚临床感染(sub
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clinical infection)或假阳性。在复杂、复发和特殊病例中，抗生素开处方过度(Overprescribing antibiotics)最为突出。这些包括儿童发热(febrile children)、阻塞性患者(obstructed patients)，诸如有BPH、肾结石的男性，特别是用重复仪器的那些男性、有妊娠期间感染的女子、住院患者和免疫受损的患者。在这些情况下，临床医师倾向于更激进地(aggressively)治疗。加速周转(turnaround)将允许临床医师通过无延迟地施用正确的抗微生物剂方案来改善患者的护理。因此，为了改善新兴抗微生物剂耐受性的问题并改善护理，初级护理设施(primary care settings)的医师要求鉴定病原体并确定其抗微生物剂易感性的超快速测试。因此，需要的是用于快速地且准确地诊断感染和抗微生物剂耐受性或易感性的装置和方法。
[0008]专利技术概述
[0009]在一方面，本专利技术提供可以快速地鉴定细胞(包括癌细胞)或微生物(包括病原体)，定量它们的载量，并诊断它们对药物诸如抗生素的易感性或耐受性的装置和方法。在一些实施方案中，装置可以使用可以起源于多种样品类型(包括临床或环境样品)的单独微生物或细胞来实现药物易感性或药物耐受性的表型检测和代谢分析。这些样品类型可以包括，但不限于，血液、脑脊髓液(cerebral spinal fluid)(CSF)、唾液和尿液，并且还可以包括诸如来自水或医院表面(hospital surface)的环境样品。在一些实施方案中，装置能够使细胞与药物诸如抗生素孵育，并然后在无污染的平台快速地提取和定量核酸或其他分
子。装置可以在微流体装置中使用数字单分子测量，所述单分子测量提供改善检测限值同时提供定量数据的超灵敏的测量，对区分病原体与污染物并且实现较早区分药物耐受与易感生物体或细胞非常重要。在一些实施方案中，这些装置可以区分来自临床样品的单独微生物或细胞的状态，并且了解它们对药物(诸如例如抗生素)的单独响应的时机，提供超快的药物
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易感性测量。
[0010]在一些实施方案中，与样品相关的数据包括来自大于一个空间分离隔室的测量，隔室的每一个包含样品的一部分。
[0011]在一些实施方案中，样品经历核酸扩增。在一些实施方案中，核酸扩增反应是环介导的扩增(LAMP)反应。在一些实施方案中，核酸扩增反应是PCR反应。在一些实施方案中，方法在约55℃
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65℃或在55℃
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65℃的温度范围来进行。在一些实施方案中，样品的至少一部分被分区为包含至少2个或更多个的阵列。在一些实施方案中，阵列是滑动芯片(SlipChip)。在一些实施方案中，被扩增的核酸是RNA。
[0012]本文还提供了用于检测和定量来自样品的靶分子的方法，所述方法包括：提供第一样品和第二样品，所述第一样品包含来自细菌群体的第一部分的靶分子，所述第二样品包含来自所述细菌群体的第二部分的靶分子，其中第一部分已用抗生素处理，并且其中第二部分未用抗生素处理；在多个第一分析区域中分配所述第一样品；在多个第二分析区域中分配所述第二样品；使第一分析区域和第二分析区域的每一个与用于进行反应的试剂接触以检测第一分析区域和第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在；以及检测第一分析区域和第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在，其中每一个样品在分析区域中的分配被实现为使得在所述反应之后在第一分析区域和第二分析区域的一些中检测到阈值数目的靶分子，并且在第一分析区域和第二分析区域的一些中未检测到阈值数目的靶分子。
[0013]在一些实施方案中，阈值数目大于零、一、二、三、四或五。在一些实施方案中，每一个样品在分析区域中的分配被实现为使得分析区域的至少一些不具有靶分子，并且分析区域的至少一些仅具有一个靶分子。在一些实施方案中，每一个样品在分析区域中的分配被实现为使得至少一个分析区域仅包含一个靶分子。在一些实施方案中，第一样品包含所述试剂，并且其中使多个第一分析区域与试剂接触包括在所述多个第一分析区域中分配所述第一样品的所述步骤。在一些实施方案中，第二样品包含所述试剂，并且其中使多个第二分析区域与试剂接触包括在所述多个第二分析区域中分配所述第二样品的所述步骤。
[0014]在一些实施方案中，反应包括核酸扩增。在一些实施方案中，核酸扩增是基本上等温的。在一些实施方案中，核酸扩增是聚合酶链式反应。在一些实施方案中，核酸扩增是基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、全基因组扩增、多重置换扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切口酶扩增反应、重组聚合酶扩增、逆转录PCR或连接介导的PCR。
[0015]在一些实施方案中，所述分析区域包括孔。在一些实施方案中，靶分子是核酸。在一些实施方案中，试剂是核酸扩增试剂。在一些实施方案中，检测和定量来自样品的靶分子的方法还包括将分析区域的每一个暴露于有效扩增核酸的条件。
[0016]在一些实施方案中，靶分子包括细菌染色体或质粒的区段。在一些实施方案中，靶分子距离复制起点小于50kDa、小于100kDa、小于200kDa、或小于400kDa。在一些实施方案
中，靶分子包括在所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于确定细菌群体对抗生素的耐受性或易感性的方法，所述方法包括：提供第一样品和第二样品，所述第一样品包含来自细菌群体的第一部分的靶分子，所述第二样品包含来自所述细菌群体的第二部分的靶分子，其中所述第一部分已用抗生素处理，其中所述第二部分未用所述抗生素处理，并且其中所述靶分子是细菌染色体或质粒的区段；在多个第一分析区域中分配所述第一样品；在多个第二分析区域中分配所述第二样品；使所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个与用于进行反应的试剂接触以检测所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在；检测所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在，其中每一个样品在所述分析区域中的分配被实现为使得在所述反应之后在所述第一分析区域和所述第二分析区域的一些中检测到阈值数目的靶分子，并且在所述第一分析区域和所述第二分析区域的一些中未检测到阈值数目的靶分子；以及分析所述检测的结果以确定所述细菌群体对所述抗生素的耐受性或易感性。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述阈值数目大于零、一、二、三、四或五。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每一个样品在所述分析区域中的分配被实现为使得所述分析区域的至少一些不具有所述靶分子，并且所述分析区域的至少一些仅具有一个靶分子。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述反应包括核酸扩增。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸扩增是基本上等温的。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述靶分子包括mRNA。7.根据权利要求4
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6中任一项所述的方法，其中所述靶分子通过扩增反应扩增，所述扩增反应包含与所述靶分子的序列互补的引物。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述试剂被布置在多个试剂区域中，并且通过使所述多个试剂区域与所述第一多个分析区域或所述第二多个分析区域流体连通来实现接触。9.根据权利要求8所述的方法，其中接触包括在包含所述试剂区域的基底与包含所述第一多个分析区域和所述第二多个分析区域的基底之间实现相对移动。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中在所述第一样品暴露于所述抗生素结束之后小于45分钟、小于30分钟、小于15分钟或小于10分钟进行所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在的所述检测。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中来自所述第一样品的所述细菌已用抗生素处理持续以下的时间段：不超过2小时、不超过1小时、不超过45分钟、不超过30分钟、不超过15分钟或不超过10分钟。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个分析区域和所述第二多个分析区域各自包括至少10个、20个、30个、40个或50个分析区域。13.一种确定细菌群体对抗生素的耐受性或易感性的方法，所述方法包括：将细菌群体分配到多个克隆分离区域中，所述分配被实现为使得所述克隆分离区域的至少一些被统计地估计为各自包含单个分离的细菌；
扩增所述单个分离的细菌的每一个以产生多个克隆群体；将所述多个克隆群体的每一个分配到来自多个处理区域的至少一个处理区域中和来自多个对照区域的至少一个对照区域中；使第一多个处理区域与抗生素接触，所述多个对照区域不与所述抗生素接触；对于所述第一多个处理区域的每一个和所述多个对照区域的每一个，将来自每一个克隆群体的一个或更多个靶分子分配到不同的多个分析区域中，其中所述靶分子是细菌染色体或质粒的区段；使所述分析区域的每一个与用于进行反应的试剂接触以检测所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在；检测所述第一分析区域和所述第二分析区域的每一个中阈值数目的靶分子的存在或不存在，其中每一个样品在所述分析区域中的分配被实现为使得在所述反应之后在所述不同的多个分析区域的一些中检测到阈值数目的靶分子，并且在所述不同的多个分析区域的一些中未检...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢斯特曼，
申请(专利权)人：达丽斯生物医学公司，
类型：发明
国别省市：