一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种靶向真菌β

【技术实现步骤摘要】
一种靶向真菌
β
‑
碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种靶向真菌β
‑
碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]真菌感染是热区环境及夏季作业的常见病因之一。浅部真菌病在执行特殊任务(船舶、雨林、海岛、抗洪抢险)的作业人员中发病率居高不下，易在作业人员中传染是皮肤真菌病的一大特点，尤其是疲劳、机体抵抗力降低，使皮肤真菌病的患病率急剧上升。因此，真菌性皮肤病不仅影响患者身体健康，而且严重降低湿热环境劳动人员的作业能力。近年来的抗真菌药物研究取得了较大进展，但其毒副作用和耐药菌株产生，为临床抗真菌的治疗提出挑战。再加上广谱抗感染药物滥用，抗肿瘤药物和免疫抑制剂的高剂量使用，使真菌病的发病率日趋增高，因此，筛选出能够针对真菌全新靶点的抑制化合物对于皮肤真菌病的防治具有重要意义。二氧化碳(CO2)不仅细胞呼吸代谢的终产物，也是一种重要的信号分子，参与多种生物过程的调节。比如，CO2是吸血性雌蚊寻找合适目标的主要信号分子，高浓度二氧化碳能促进动物生殖细胞的成熟和游动，甚至影响小型动物(如线虫)的寿命。许多真菌(如白色念珠菌)既是人体重要的病原真菌，也是健康人群体内常见的共生菌。CO2作为微生物生命活动的重要信号分子，正常空气中 CO2的含量约为0.03％，动物体内等约为4.5％～30％，参与多种生物过程的调节。人体内CO2浓度远远高于空气中CO2浓度，研究表明，CO2在病原真菌白色念珠菌形态转换和感染宿主过程中起重要的调控作用。高浓度CO2促进菌丝生长和灰菌(opaque)形成，从而促进白色念珠菌在体内定植。这种应答作用是该菌与宿主相互作用及其长期适应性进化的结果。因此，CO2在生物进化和细胞生命活动中起非常重要的作用。碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA)是一种含Zn
2+
金属酶，能有效地催化 CO2和HCO3‑
的可逆水合反应。根据其遗传学差异，CAs分为五个家族α,β,γ,δ,ε。其中α
‑
CA研究最为深入，包括16个亚型，存在于哺乳动物(人和鼠)、植物、原核生物及真菌中，在呼吸、光合作用、CO2传输、酸碱平衡的维持、离子输送等生物过程中发挥着重要的作用。近年来开始有报道从植物、原核生物及真菌中鉴定出β
‑
CA的存在，不存在于哺乳动物，且β
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CA的活性中心不同于人源α
‑
CA，是理想的抗真菌药物靶标。目前研究发现，β
‑
CA不仅在致病真菌的CO2传感系统中发挥重要作用，而且参与真菌有性繁殖和致病机制，其主要作用cAMP信号通路，激活PKA，而发挥感染、毒力转移和繁殖的作用，这一途径目前得到证实。因此，β
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CA是理想的抗真菌药物靶标。另外有报道发现，针对白色念珠菌和新隐球菌等深部真菌感染致病菌的β
‑
CA(CAN和NCE)，合成筛选了系列磺胺类先导化合物，并对其作用机制进行了初步探索，该类化合物主要是在目前现有磺胺类药物结构的改构，其在药物结构创新有待进一步提升。我国科研人员首次发现Flo8对于CO2诱导的菌丝生长和灰菌形成都是必需的，Flo8含有一个真核生物中保守的LisH结构域，不仅调节CO2诱导的白色念珠菌“酵母
‑
菌丝形态”转换，也控制了“白菌
‑
灰菌”之间的转换，过表达Flo8基因则增强了白色念珠菌细胞感应CO2的敏
感性，在此过程中β
‑
CA发挥重要的作用。因此，不论是作用于β
‑
CA现有药物衍生化合物的研究，还是和β
‑
CA相关通路的重要基因和蛋白的研究，均说明β
‑
CA在真菌的生命系统的特异性和重要性，是作为理想药物靶标的基础，值得进一步深入的研究。因此，开展靶向β
‑
CA的抑制剂筛选研究对于新一代防治真菌病新型药物的研究具有重要的意义。

技术实现思路

针对现有技术中的上述问题，本专利技术提出了一种靶向真菌β
‑
碳酸酐酶的抑制剂的制备方法。第一方面，本专利技术提出了一种靶向真菌β
‑
碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，包括如下步骤：S101：将待筛选抗真菌化合物及对照药物分别用DMSO溶解后配置成浓度为6mg/mL～7mg/mL的母液，在
‑
85℃～
‑
75℃温度下保存；S102：将所述对照药物配置成母液，在
‑
85℃～
‑
75℃温度下保存；S103：分别取上述母液，将每一种母液分别加入RPMI 1640培养液，充分振荡混匀，稀释为640μg/mL中间浓度；S104：将50μL待筛选抗真菌化合物和浓度为6.4mg/mL阳性药母液加入到含450μLRPMI 1640培养液的1mL深孔板中混匀；氟康唑母液取160μL，加入含340μL RPMI 1640培养液的1mL深孔板中混匀，各药物得浓度为640μg/mL 测试液；10级倍比稀释，得到640～1.25μg/mL 10个浓度的测试液；S105：取上述各测试液640～1.25μg/mL 10个浓度的测试液各20μL，分别分装于96孔板各排2～11号孔内制成药敏板；S106：将受试菌株分别制备成浓度介于1
×
103～5
×
103CFU/mL的酵母菌菌悬液和浓度介于2
×
103～1
×
104CFU/mL丝状真菌菌悬液；S107：取药敏板中依次加入上述于每排1号孔加RPMI 1640培养液200μL，作空白对照；12号孔加待测菌株200μL，作阴性对照；药敏板每排2～11号孔分别加菌液180μL，充分混匀，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、 2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阴性对照；药敏板H排为氟康唑和质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019；S108：针对所述待筛选抗真菌化合物的适宜温度范围对所述待筛选抗真菌化合物进行培养；S109：通过培养结果确定最低抑菌浓度，选择得到靶向真菌β
‑
碳酸酐酶的抑制剂。本专利技术的靶向真菌β
‑
碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，可以有效筛选出具有较强抑制真菌活性的药物，对于新一代防治真菌病新型药物的研究具有重要的意义。作为本专利技术的具体实施方式，在所述步骤S106中，所述受试菌株选自白假丝酵母菌Y0109、白假丝酵母菌SC5314、近平滑假丝酵母菌ATCC 22019、光滑假丝酵母菌537、新生隐球菌32609、石膏状小孢子菌Cmccfmza、红色毛癣菌 Cmccftla和烟曲霉菌07544中的至少一种。作为本专利技术的具体实施方式，在所述步骤S101中，所述真菌培养基至少选自RPMI 1640培养液、YEPD培养液、沙堡葡萄糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的一种。
作为本专利技术的具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向真菌β
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碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：将待筛选抗真菌化合物及对照药物分别用DMSO溶解后配置成浓度为6mg/mL～7mg/mL的母液，在
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85℃～
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75℃温度下保存；S102：将所述对照药物配置成母液，在
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85℃～
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75℃温度下保存；S103：分别取上述母液，将每一种母液分别加入RPMI 1640培养液，充分振荡混匀，稀释为640μg/mL中间浓度；S104：将50μL待筛选抗真菌化合物和浓度为6.4mg/mL阳性药母液加入到含450μLRPMI 1640培养液的1mL深孔板中混匀；氟康唑母液取160μL，加入含340μL RPMI 1640培养液的1mL深孔板中混匀，各药物得浓度为640μg/mL测试液；10级倍比稀释，得到640～1.25μg/mL 10个浓度的测试液；S105：取上述各测试液640～1.25μg/mL 10个浓度的测试液各20μL，分别分装于96孔板各排2～11号孔内制成药敏板；S106：将受试菌株分别制备成浓度介于1
×
103～5
×
103CFU/mL的酵母菌菌悬液和浓度介于2
×
103～1
×
104CFU/mL丝状真菌菌悬液；S107：取药敏板中依次加入上述于每排1号孔加RPMI 1640培养液200μL，作空白对照；12号孔加待测菌株200μL，作阴性对照；药敏板每排2～11号孔分别加菌液180μL，充分混匀，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阴性对照；药敏板H排为氟康唑和质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019；S108：针对所述待筛选抗真菌化合物的适宜温度范围对所述待筛选抗真菌化合物进行培养；S109：通过培养结果确定最低抑菌浓度，选择得到靶向真菌β
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碳酸酐酶的抑制剂。2.根据权利要求1所述的靶向真菌β
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碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤S106中，所述受试菌株选自白假丝酵母菌Y0109、白假丝酵母菌SC5314、近平滑假丝酵母菌ATCC 22019、光滑假丝酵母菌537、新生隐球菌32609、石膏状小孢子菌Cmccfmza、红色毛癣菌Cmccftla和烟曲霉菌07544中的至少一种。3.根据权利要求1所述的靶向真菌β
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碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤S101中，所述真菌培养基至少选自RPMI 1640培养液、YEPD培养液、沙堡葡萄糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的一种。4.根据权利要求2所述的靶向真菌β
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碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤S108中，白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌或近平滑假丝酵母菌在35℃静置培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景峰，王尚，谌志强，邱志刚，李超，赵辰，薛斌，李辰宇，张曦，杨晓波，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：