一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法技术

本发明专利技术属于蛋白质提纯技术领域，具体涉及一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法。包括以下步骤：在盐酸、乙醇的混合溶液中加入海藻酸，过滤后将滤渣依次用盐酸、蒸馏水、醋酸进行抽滤，得到处理后的海藻酸，冷藏备用；鹰嘴豆浸泡后发芽，将发芽后的鹰嘴豆放入含有巯基乙醇的醋酸溶液中匀浆，提取后得到上清液；在得到的上清液中加入海藻酸，搅拌吸附，用布氏漏斗收集吸附了蛋白质的海藻酸，清洗后用盐酸充分洗脱被吸附的蛋白质，将洗脱液调节至酸性，加入氯化钠进行盐析，收集盐析物。本发明专利技术采用的提取胰安肽的工艺操作简单，条件温和且限制少，容易实现大规模生产，具有极大的商业价值。具有极大的商业价值。具有极大的商业价值。

【技术实现步骤摘要】
一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白质提纯
，具体涉及一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法。

技术介绍

[0002]胰安肽是从豆类种子中提取的具有37个氨基酸残基的新生物活性多肽。作为植物多肽的一种，胰安肽与糖脂代谢有关，结构与胰岛素类似，也可有效降低血糖水平，是临床治疗糖尿病的有效药物之一。目前研究表明胰安肽降低血糖的功效优于胰岛素，且副作用低、疗效高、符合原料药标准，最为重要的是，胰岛素只能通过注射达到降低血糖的目的，而胰安肽可通过口服发挥疗效，能有效提高糖尿病患者用药的方便性，减轻痛苦。经体外酶学实验证实，胰安肽胱氨酸高级结构能抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种酶解，并在实验动物中未观察到任何毒副作用，故可望开发成为口服降糖新药。
[0003]鹰嘴豆，作为豆科鹰嘴豆属植物，其蛋白质含量很高，是人们主要蛋白质来源之一。鹰嘴豆营养丰富，含有多种氨基酸和矿物质，以及碳水化合物、烟酸、维生素、膳食纤维、脂肪等营养成分，因而具有较高的食用和药用价值。目前对胰安肽的研究主要集中于豌豆和黄豆上，对鹰嘴豆中胰安肽的研究较少，据报道鹰嘴豆中胰安肽的含量十分可观。
[0004]至目前尚无提取纯化鹰嘴豆中胰安肽的实验。

技术实现思路

[0005]本项目借助红外分光光度计、紫外分光光度计和高效液相色谱法等技术手段，从鹰嘴豆中成功提取胰安肽并纯化，可为胰安肽口服制剂的研发提供重要的技术支持。
[0006]与现有技术比较，本专利技术取得的技术效果是：
[0007]1、本专利技术采用的提取工艺能够切实可行地从鹰嘴豆中提取出一定量的蛋白质并证明其为胰安肽。
[0008]2、本专利技术制备的胰安肽冻干对于研究鹰嘴豆中胰安肽的分离纯化工艺和寻找新的糖尿病治疗药物及手段极重大的探索价值。
[0009]3、本专利技术采用的提取胰安肽的工艺操作简单，条件温和且限制少，容易实现大规模生产，具有极大的商业价值。
附图说明
[0010]图1为使用甲醇提取鹰嘴豆蛋白多肽的红外光谱(IR)图；
[0011]图2为使用丙酮提取鹰嘴豆蛋白多肽的红外光谱(IR)图；
[0012]图3为用甲醇提取的稀释适当倍数的蛋白溶液的紫外光谱(UV)图；
[0013]图4为用丙酮提取的稀释适当倍数的蛋白溶液的紫外光谱(UV)图；
[0014]图5为用甲醇提取的蛋白溶液的液相色谱图；
[0015]图6为用丙酮提取的蛋白溶液的液相色谱图。
具体实施方式
[0016]实施例1鹰嘴豆中胰安肽的提取
[0017]1、海藻酸的处理
[0018]称取100g海藻酸(Sigma)，加入1L处理液(0.2L 2mol
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‑1盐酸+0.8L乙醇)，搅拌30min后用布氏漏斗收集滤渣。在布氏漏斗上反复加入少量上述处理液抽滤，直到滤液无色。接着将收集的滤渣(海藻酸)悬浮于2L的0.2mol
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‑1盐酸溶液中，完全沉淀后倒去上清液，再用布氏漏斗收集沉淀下来的海藻酸。在布氏漏斗上加入一定量的蒸馏水洗去吸附在海藻酸上的盐酸。然后将海藻酸重新悬浮于0.5mol
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L
‑1的醋酸中，沉淀后再次用布氏漏斗收集，最后贮存于
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20℃的冰箱中备用。
[0019]2、种子的萌发与提取
[0020]称取鹰嘴豆100g，在室温下浸泡12小时后将水倒掉，然后平铺于带滤纸的白瓷盘里25℃发芽60小时。配置提取液2L 0.5mol
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‑1醋酸溶液(含体积分数为0.1％巯基乙醇)，预冷至4℃。取400ml提取液加入萌发的种子中匀浆，匀浆完后将剩余的1.6L提取液全部加入其中，用磷酸三丁酯消去泡沫，在4℃的条件下搅拌提取24小时后，7000rpm离心得到上清液。
[0021]3、蛋白质的吸附与洗脱
[0022]上清液用4mol
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‑1的盐酸调pH至2.7后加适量海藻酸，搅拌吸附12小时后，用布氏漏斗收集吸附了蛋白质的海藻酸，并在布氏漏斗上加蒸馏水清洗海藻酸。再用0.2mol
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‑1的盐酸充分洗脱被吸附的蛋白质，洗脱液(滤液)用无水乙酸钠调至pH3.5，最后加入饱和的氯化钠(320g/L)进行盐析，用布氏漏斗抽滤收集得到盐析物。
[0023]4、甲醇和丙酮的提取
[0024]称取1g(湿重)盐析物溶于10mL的超纯水(预冷至4℃，含体积分数为0.1％巯基乙醇)中，12000rpm离心后取上清液。取两份等量的上清液，分别加入甲醇和丙酮，使甲醇终浓度为60％，丙酮终浓度为80％，然后于
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20℃冰箱放置12小时，再于12000rpm离心后取上清液，上清液通过低温减压使溶液中的甲醇和丙酮挥发，于
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70℃冰箱中放置8小时后，通过冷冻干燥机进行冻干，得到提取纯化后的胰安肽样品。
[0025]实施例2鹰嘴豆中胰安肽的检测
[0026]1、红外
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可见分光光度法进行检测
[0027]称取约1mg经干燥至衡重的提取样品于玛瑙研钵中，充分研磨，再加入约100mg的溴化钾粉末，均匀研磨至粒径小于2μm，置于模具中，用60Pa压力在油压机上压制成透明薄片，分别进行红外扫描，扫描波长为400cm
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4000cm，分别记录FT
‑
IR图。由图1，2可知，波数在3303cm
‑1处出现了典型的
‑
OH吸收峰，2935cm
‑1出现的峰是由
‑
CH2‑
反对称伸缩振动产生的，在2356cm
‑1处的吸收峰是由CO2反对称伸缩振动引起的，1653cm
‑1处的吸收峰是由蛋白质酰胺I带特征基团R—CO—NH2中—C＝O—伸缩振动产生的，1530cm
‑1处吸收峰是由蛋白质仲酰胺基团中的—NH面内弯曲振动产生的，1390cm
‑1处较弱的吸收峰由蛋白质中游离的COO—对称伸缩振动产生的。证明从鹰嘴豆中成功提取出胰安肽。
[0028]2、紫外
‑
可见分光光度法
[0029]称取一定质量的胰安肽样品，溶于去离子水中，稀释到适当的倍数配制成一定质量浓度的蛋白溶液，然后用紫外
‑
可见分光光度计在200～400nm的波长范围内进行扫描测
定。由图3，4可知，在波长200～400nm范围内对蛋白溶液进行紫外
‑
可见光谱扫描时，200nm波长处出现最大吸收峰，且其他波长处曲线较平缓，未见明显杂峰，而蛋白溶液的紫外
‑
可见光光谱的最大吸收峰在214nm波长附近。由此可知提取的鹰嘴豆蛋白纯度较高，且结合分光光度法测得纯度数据结果可知，说明该方法提取制备鹰嘴胰安肽的方法可靠。
[0030]实施例3鹰嘴豆中胰安肽的纯化
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在盐酸、乙醇的混合溶液中加入海藻酸，过滤后将滤渣依次用盐酸、蒸馏水、醋酸进行抽滤，得到处理后的海藻酸，冷藏备用；2)鹰嘴豆浸泡后发芽，将发芽后的鹰嘴豆放入含有巯基乙醇的醋酸溶液中匀浆，提取后得到上清液；3)在步骤2)得到的上清液中加入步骤1)得到的海藻酸，搅拌吸附，用布氏漏斗收集吸附了蛋白质的海藻酸，清洗后用盐酸充分洗脱被吸附的蛋白质，将洗脱液调节至酸性，加入氯化钠进行盐析，收集盐析物。2.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述的盐酸、乙醇的混合溶液为0.2L 2mol
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‑1盐酸和0.8L乙醇的混合溶液。3.根据权利要求2所述的一种鹰嘴豆中胰安肽的提取及纯化方法，其特征在于，步骤1)中，按固液比，海藻酸：盐酸、乙醇的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王家欢，张金花，陈安琪，刘宇，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：