贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)变体及其用途制造技术

本文提供了用于甜菊醇糖苷的改良生产的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。所述宿主细胞被遗传修饰成含有表达新型的优化的Ro.KAH变体的异源核酸。所述宿主细胞进一步含有一种或多种异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码进一步的能够在所述宿主细胞中产生一种或多种甜菊醇糖苷的途径的酶。本文所述的宿主细胞、组合物和方法提供了用于异源生产包括莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M在内的甜菊醇糖苷的有效途径。菊醇糖苷的有效途径。菊醇糖苷的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】贝壳杉烯酸13
‑
羟化酶(KAH)变体及其用途
[0001]序列表
[0002]本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式通过电子方式提交并通过引用的方式整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年4月30日，名称为51494
‑
009WO2_Sequence_Listing_4_30_20_ST25，大小为100,106字节。


[0003]本公开涉及贝壳杉烯酸13
‑
羟化酶(KAH)变体、包含该变体的宿主细胞以及它们用于生产异源分子的方法。

技术介绍

[0004]需要源自天然来源的低热量甜味剂，以限制高糖摄入对健康的影响。甜菊植物(甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni))产生多种称为甜菊醇糖苷的甜味糖基化二萜。在所有已知的甜菊醇糖苷中，Reb M具有最高的效力(比蔗糖甜约300倍)，并且具有最吸引人的风味特征。然而，甜菊植物仅会少量生产Reb M，并且产生的Reb M仅占总甜菊醇糖苷含量的一小部分(<1.0％)，因此从甜菊叶中分离Reb M是不切实际的。需要获取Reb M的替代方法。一种此类途径是应用合成生物学来设计从可持续原料来源生产大量Reb M的微生物(例如酵母)。
[0005]为了使用合成生物学经济地生产产品，从原料到产品的生物转化中每一步都需要具有高转化效率(理想情况下>90％)。在我们对酵母进行工程化以生产Reb M时，我们注意到当使用野生型酶时，特定的酶促步骤在酵母中表现不佳。为了改善微生物中Reb M的生产率和产量，我们试图生产比野生型酶表现更好的变体酶。一种此类酶是贝壳杉烯酸13
‑
羟化酶(KAH)，其催化对映贝壳杉烯酸(ent
‑
kaurenoic acid)转化为甜菊醇。

技术实现思路

[0006]本文提供了用于贝壳杉烯酸向甜菊醇的改良转化的组合物和方法。这些组合物和方法部分地基于某些能够将贝壳杉烯酸高效转化为甜菊醇的变体贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)的产生。
[0007]在一个方面，本专利技术提供了宿主细胞，该宿主细胞具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％序列同一性的贝壳杉烯酸羟化酶多肽。
[0008]在一个方面，本专利技术总体上提供了具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其中该序列进一步含有一个或多个氨基酸取代。
[0009]在另一个方面，本专利技术提供了编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体贝壳杉烯酸羟化酶多肽的核酸，其中所述序列进一步含有一个或更多个氨基酸取代。在另一个方面，本专利技术提供了编码本文所述的任何一种变异多肽的核酸。
[0010]在又一个方面，本专利技术提供了含有具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体贝壳杉烯酸羟化酶多肽的宿主细胞，其中所述序列进一步含有一个或更多个氨基酸取代。在另一
个方面，本专利技术提供了包含本文所述的任何一种多肽或核酸的宿主细胞。
[0011]在另一个方面，本专利技术提供了含有编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变体贝壳杉烯酸羟化酶多肽的核酸的宿主细胞，其中所述序列进一步含有一个或更多个氨基酸取代。
[0012]在一个实施方案中，本专利技术提供了一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自K69R、V343G、T403V、H491P、P72D、L64D、Q84C、L64G、E206D、Y238C、A210G、L64N、I237C、L11V、N207F、M73G、W8G、E60R、Y55S、N475G、D292P、P161C、K267D、L485F、A396F、R507A、P72T、I132G、N61P、K119V、T220E、P72G、Q513R、S133G、Y506V、K69P、E60G、K224C、M73H、H379G、P72C、K314P、W202A、G466F、N49A、S339G、N160D、T216G、D102Y、F246G、M58P、T220R、R458D、M58G、A68I、S70P、F88V、T240D、L205I、K167G、L232M、S62R、G56D、Q244G、A242D、N49R、Q513G、W29T、L303D、T378D、I508L、W202Q、S505R、R233C、I104D、M258G、K69G、F88D、F88S、A217V、E230C、R507G、G466S、G56S、E230G、Y55G、A503C、S460I、I129R、S245G、F246S、Q84L、S133R、T509V、R507E、R233T、V30F、A68G、G56N、T162G、A68P、S165D、K119Y、W29C、S165P、W29V、I284G、A217L、Q335V、L65S、F53R、Y55P、W202V、K224V、W29A、H164G、Q244D、K291C、L65G、K167S、C327I、K291S、D57G、K167H、N160T、W202C、A242G、F88R、I104N、G466D、N475D、K119S、T123D、T216A、S339A、P161D、I104R、L54G、M171F、L232Y、D293C、V340A、T162A、A297V、I104H、F332L、A236R、K224I、S452D、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自N146W、A297Y、A236S、V9S、G466F、T283D、T142G、T425V、L459C、T283A、T283G、S460V、S133G、I129V、W52G、S505I、I243T、V340S、S460C、S452D、L118I、S505V、T123D、W52C、S460I、S457G、W52R、W52N、N146T、G466A和W52T。在特定的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A297V、I104H、F332L、A236R、K224I、S452D、I104A、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。在优选的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自S452D、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。在进一步的实施方案中，变异多肽的N末端信号序列被另一种p450多肽的信号序列取代。在一些实施方案中，所述N末端信号序列对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1
‑
25。在一些实施方案中，所述的另一种p450多肽的信号序列具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异多肽包括氨基酸取代A297Y，并且可能还包括一个或多个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，变异多肽包括包含N146T/A297Y的氨基酸取代，并且可能还包括一个或多个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，变异多肽具有选自N146T/A297Y/G466A、W52T/N146T/A297Y、T142G/N146T/A297Y/G4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种变异的贝壳杉烯酸羟化酶多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述序列进一步包含一个或多个氨基酸取代。2.如权利要求1所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自K69R、V343G、T403V、H491P、P72D、L64D、Q84C、L64G、E206D、Y238C、A210G、L64N、I237C、L11V、N207F、M73G、W8G、E60R、Y55S、N475G、D292P、P161C、K267D、L485F、A396F、R507A、P72T、I132G、N61P、K119V、T220E、P72G、Q513R、S133G、Y506V、K69P、E60G、K224C、M73H、H379G、P72C、K314P、W202A、G466F、N49A、S339G、N160D、T216G、D102Y、F246G、M58P、T220R、R458D、M58G、A68I、S70P、F88V、T240D、L205I、K167G、L232M、S62R、G56D、Q244G、A242D、N49R、Q513G、W29T、L303D、T378D、I508L、W202Q、S505R、R233C、I104D、M258G、K69G、F88D、F88S、A217V、E230C、R507G、G466S、G56S、E230G、Y55G、A503C、S460I、I129R、S245G、F246S、Q84L、S133R、T509V、R507E、R233T、V30F、A68G、G56N、T162G、A68P、S165D、K119Y、W29C、S165P、W29V、I284G、A217L、Q335V、L65S、F53R、Y55P、W202V、K224V、W29A、H164G、Q244D、K291C、L65G、K167S、C327I、K291S、D57G、K167H、N160T、W202C、A242G、F88R、I104N、G466D、N475D、K119S、T123D、T216A、S339A、P161D、I104R、L54G、M171F、L232Y、D293C、V340A、T162A、A297V、I104H、F332L、A236R、K224I、S452D、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。3.如权利要求2所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自A297V、I104H、F332L、A236R、K224I、S452D、I104A、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。4.如权利要求3所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自S452D、I104A、V340S、F229Y、A297Y和A297F。5.如权利要求1所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自N146W、A297Y、A236S、V9S、G466F、T283D、T142G、T425V、L459C、T283A、T283G、S460V、S133G、I129V、W52G、S505I、I243T、V340S、S460C、S452D、L118I、S505V、T123D、W52C、S460I、S457G、W52R、W52N、N146T、G466A和W52T。6.如权利要求1所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包含A297Y。7.如权利要求1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：阿米瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：