本发明专利技术公开了一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用，涉及植物基因工程领域，通过构建含有蛋白MsLEA1的编码基因的表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株，本发明专利技术利用基因工程技术调控紫花苜蓿
【技术实现步骤摘要】
一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用
[0001]本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用。
技术介绍
[0002]紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草，因其生长迅速、适口性好、营养价值高，被誉为
‘
牧草之王
’
，在畜牧业生产中具有重要作用。而干旱、盐胁迫是北方紫花苜蓿生长的主要限制因子；酸性土壤中高活性铝离子(Al
3+
)对苜蓿产生的毒害作用是南方苜蓿种植的主要限制因素。
[0003]胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogensis abundant proteins，LEA蛋白)是一类重要的逆境响应蛋白，参与调控植物响应逆境胁迫过程，增强植物的抗逆能力。LEA蛋白以分子伴侣的形式保护蛋白、酶活、核酸、磷脂结构等，提高转基因植物的抗逆能力。目前，有关LEA蛋白参与植物铝胁迫响应的研究报道相对空白。
[0004]因此，利用基因工程技术调控紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1基因表达，从而提高紫花苜蓿耐铝、抗旱性，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于填补紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1基因的克隆、表达模式以及紫花苜蓿
‘<br/>WL525
’
MsLEA1蛋白的空白；
[0006]本专利技术提供了一种紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1，所述蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1蛋白特征的蛋白质。
[0007]另一方面，本专利技术提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0008]优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQ ID NO.1第1～600位所示；或(b)与SEQ ID NO.1第1～795位所示的核酸有至少70％的同源性的序列。
[0009]在本专利技术中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0010]在本专利技术中，术语“紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白编码基因”指编码具有紫花苜蓿
‘
WL525
’
蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸序列及其简并序列。
[0011]所述简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。
[0012]该术语还包括能编码天然紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的相同功能、SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。
[0013]所述变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5
′
和/或3
′
端添加为60个以内核苷酸。
[0014]在本专利技术中，可用实时荧光定量PCR的方法分析紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1基因产物的表达模式，即分析紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0015]此外，根据本专利技术的紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1基因相关同源基因或同源蛋白。
[0016]本专利技术的紫花苜蓿
‘
WL525
’
MsLEA1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
[0017]对于PCR扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0018]此外，还可通过化学合成将突变引入本专利技术蛋白序列中。
[0019]除了用重组法产生之外，本专利技术蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。可以分别化学合成本专利技术蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
[0020]本专利技术还提供一种重组表达载体，包含所述紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因SEQ ID NO.1所示序列、简并序列或变异形式。
[0021]优选的，所述重组表达载体为pHB
‑
Flag
‑
MsLEA1。
[0022]所述重组表达载体pHB
‑
Flag
‑
MsLEA1的制备方法为将MsLEA1的基因插入到质粒pHB
‑
Flag上的BamHI与SpeI限制性酶切位点之间。
[0023]本专利技术还提供一种重组菌，其特征在于，通过将所述重组表达载体转化宿主细胞而获得。
[0024]优选的，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。
[0025]本专利技术所述任一紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，重组表达质粒或重组菌在提高紫花苜蓿耐铝毒及抗旱中的应用。
[0026]本专利技术的优点在于：首次克隆紫花苜蓿
‘
WL525
’
干旱、铝胁迫过程中的重要响应蛋白MsLEA1的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析MsLEA1基因的表达模式，烟草叶片表皮细胞瞬时表达分析MsLEA1蛋白的定位，为今后利用基因工程技术调控MsLEA1基因的时空表达，从而提高紫花苜蓿耐铝、抗旱性、新品种选育方面提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1，其特征在于，所述蛋白MsLEA1包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列多肽，以及所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过缺失、插入和/或取代氨基酸且具有MsLEA1蛋白功能的变异形式多肽。2.一种编码权利要求1所述紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、所述核苷酸序列SEQ ID NO：1的简并序列、变异序列、以及能与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1杂交的序列。3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述简并序列与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的第1～600位核苷酸序列具有至少70％的同源性。4.根据权利要求2所述的紫花苜蓿
‘
WL525
’
胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述变异序列包括与所述序列SEQ ID NO：1相比存在1～90个核苷酸的缺失、...
【专利技术属性】
技术研发人员：安渊，吕爱敏，樊娜娜，高鲤，徐蕊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。