一种水稻的高光效分子育种方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻的高光效分子育种方法，涉及分子育种技术领域，包括目的基因的获取，重组质粒的构建和扩增，农杆菌转化，水稻组织转化及筛选等步骤。本发明专利技术采用分子生物手段成功将玉米的PEPC基因重组转化水稻植株，在T1～T3代都能筛选出阳性植株,并获得了T3代纯系,说明外源基因能在转基因后代中稳定遗传，通过分子育种技术成功提高了水稻的光合作用。有效利用一次性潮霉素检测装置对叶片原位浸泡检测潮霉素抗性可以省去标记环节，不会出现样本混杂和错漏的现象，利用快速潮霉素检测方法在短时间内筛选大量重组水稻植株，提高筛选效率。效率。效率。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻的高光效分子育种方法


[0001]本专利技术涉及分子育种
，具体涉及一种水稻的高光效分子育种方法。

技术介绍

[0002]水稻属C3植物，通过RuBP羧化酶固定CO2,由于RuBP羧化酶具有较高的加氧酶活性,导致大量的CO2通过光呼吸而损失掉，光合利用效率低；而C4植物固定CO2的酶为PEP羧化酶(PEPC)，对CO2的亲和力是RuBP羧化酶的几十倍，能将CO
2“泵”入维管束细胞,提高内环境CO2浓度，使C4植物保持很高的光合效率。C4植物比C3植物具有优越的光合能力，以及水稻体内客观存在着一个原初的C4光合途径，为利用C4光合酶基因进行水稻高光效基因工程育种提供了理论基础。
[0003]植物基因重组技术中通常利用潮霉素抗性作为筛选标记基因，选择标记基因潮霉素磷酸转移酶基因被证明是单子叶植物较为理想的筛选基因,因其选择效率高、基因型差异小、对转化细胞不产生或很少产生毒害作用、再生的转基因植株育性较好等优点在水稻、玉米和小麦等作物上得到了广泛应用。
[0004]现有的潮霉素检测是将水稻叶片剪下一段后浸泡在含50mg/L潮霉素B和1mg/L6
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苄氨基嘌呤水溶液中，通过观察叶片是否褐化枯死来检测水稻植株是否具有潮霉素抗性，以此来判断携带潮霉素抗性基因和目的基因的重组载体是否转化进入水稻植株内(刘巧泉,陈秀花,王兴稳,等.一种快速检测转基因水稻中潮霉素抗性的简易方法[J].农业生物技术学报,2001,9(3):264
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264.)。这种方法虽然快速便捷，但是由于叶片样本需要离体浸泡，就需要一一对应的进行植株与样本的标记，在离体样本检测结果得出后再根据标记去挑选转化成功的水稻植株，当水稻植株较多时，标记和挑选的过程极为费时，且人为操作过程容易出现错漏和样品混杂无法分辨等问题，无法高效的进行分子育种筛选。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种水稻的高光效分子育种方法，通过分子生物学方法解决现有水稻植株光合作用较弱的缺点，并提高潮霉素检测筛选的效率和准确率。
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种水稻的高光效分子育种方法，具体步骤如下：
[0008](A)设计PCR引物，以玉米的cDNA为模板进行目的基因PEPC的扩增获取；
[0009](B)将扩增的目的基因双酶切后插入质粒载体，构建重组载体后转化DH5α，筛选阳性克隆并测序验证正确后进行扩增培养，收集重组大肠杆菌进行重组质粒的抽提；
[0010](C)将重组质粒转化进入农杆菌制备侵染液；
[0011](D)将培养的水稻愈伤组织浸入侵染液中进行重组转化，利用含潮霉素和头孢霉素的选择培养基筛选2
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3代，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上进行分化，再生的小苗在1/2MSH培养基上生根壮苗3～4周后，挑选根多而粗壮的抗性植株，打开瓶盖加入蒸馏水于室内炼苗，3天后用自来水将幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的
秧盘中，待幼苗成活移入实验田，常规管理至抽穗期；
[0012](E)于抽穗期鉴定转化植株的潮霉素抗性，记录3
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4d后叶片的抗感反应，利用一次性潮霉素抗性检测装置初步筛选出抗性植株，将抗性植株PCR鉴定目的基因后继续传代培养直至获得目的基因纯系即可。
[0013]优选地，所述步骤(A)中的PCR引物为：
[0014]上游:5'
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AGGATCCAGCCAGCAGATGGCGAGC
‑
3'
[0015]下游:5'
‑
AGAGCTCCGATGAAATCAGGAGGGCAC
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3'。
[0016]优选地，所述PCR的反应条件为94℃，2min；94℃，30s；55℃，30s；72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸7min。
[0017]优选地，所述一次性潮霉素抗性检测装置包括上盒(1)，所述上盒(1)内设有隔板(11)，所述隔板(11)将上盒(1)分隔为上腔(12)和下腔(13)，所述上腔(12)顶部螺纹连接有立杆(3)，所述立杆(3)的下部设有进液腔(31)，所述进液腔(31)的四周设有若干进液孔(32)，所述进液腔(31)的底部连通有针头(5)，所述隔板(11)上设有橡胶片(111)，所述橡胶片(111)设于针头(5)的下方，所述下腔(13)内设有海绵(2)，所述海绵(2)的下部开设有插缝(21)，所述下腔(13)的底部与外部连通，所述上盒(1)的底端对称设有两个弯折板(4)，所述弯折板(4)的内端设于插缝(21)下方，所述弯折板(4)内均设有通槽(41)，其中一个弯折板(4)的两侧设有若干卡块(42)，另一个弯折板(4)的两侧设有若干卡槽(43)。
[0018]优选地，所述一次性潮霉素抗性检测装置筛选的具体方法为：测试前，向一次性潮霉素抗性检测装置的上腔12内预注入潮霉素抗性检测液(含终浓度50mg/L潮霉素B和1mg/L 6
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苄氨基嘌呤)，再旋入立杆3密封，此时针头5未插入橡胶片111。测试时，将抽穗期水稻剑叶插入通槽41内，由于两个通槽41在同一水平面上，因此剑叶直接穿过两个通槽41，将两个弯折板4滑动至剑叶中部，同时弯折夹合两个弯折板4，直至两个弯折板4互相平行，此时卡块42卡入卡槽43内固定两个弯折板4，弯折板4夹合过程中，两个弯折板4内侧之间的叶片也被对折，叶脉被折断后随弯折板4运动插入海绵2的插缝21中，此时，整个装置被固定在剑叶上，转动立杆3，直至针头5刺穿橡胶片111，上腔12内的潮霉素抗性检测液由进液孔32进入进液腔31，再由进液腔31经针头5进入下腔13内的海绵2中，海绵2吸入潮霉素抗性检测液后浸泡插缝21中的叶脉折断部，海绵2内的潮霉素抗性检测液还可通过毛细现象进入通槽41内浸泡弯折板4内的叶片，如此即可完成叶片原位浸泡检测潮霉素抗性的操作。
[0019]本专利技术的优点在于：
[0020]本专利技术采用分子生物手段成功将玉米的PEPC基因重组转化水稻植株，在T1～T3代都能筛选出阳性植株,并获得了T3代纯系,说明外源基因能在转基因后代中稳定遗传，通过分子育种技术成功提高了水稻的光合作用。有效利用一次性潮霉素检测装置对叶片原位浸泡检测潮霉素抗性可以省去标记环节，不会出现样本混杂和错漏的现象，利用快速潮霉素检测方法在短时间内筛选大量重组水稻植株，提高筛选效率。
附图说明
[0021]图1和图2为一次性潮霉素抗性检测装置的不同视角整体结构示意图。
[0022]图3为一次性潮霉素抗性检测装置的俯视图。
[0023]图4为图3中A
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A向剖视图。
[0024]图5为图3中B
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B向剖视图。
[0025]图6为目的基因PCR分析电泳结果图。
[0026]其中，1
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上盒，11
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻的高光效分子育种方法，其特征在于，具体步骤如下：(A)设计PCR引物，以玉米的cDNA为模板进行目的基因PEPC的扩增获取；(B)将扩增的目的基因双酶切后插入质粒载体，构建重组载体后转化DH5α，筛选阳性克隆并测序验证正确后进行扩增培养，收集重组大肠杆菌进行重组质粒的抽提；(C)将重组质粒转化进入农杆菌制备侵染液；(D)将培养的水稻愈伤组织浸入侵染液中进行重组转化，利用含潮霉素和头孢霉素的选择培养基筛选2
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3代，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上进行分化，再生的小苗在1/2MSH培养基上生根壮苗3～4周后，挑选根多而粗壮的抗性植株，打开瓶盖加入蒸馏水于室内炼苗，3天后用自来水将幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的秧盘中，待幼苗成活移入实验田，常规管理至抽穗期；(E)于抽穗期鉴定转化植株的潮霉素抗性，记录3
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4d后叶片的抗感反应，利用一次性潮霉素抗性检测装置初步筛选出抗性植株，将抗性植株PCR鉴定目的基因后继续传代培养直至获得目的基因纯系即可。2.根据权利要求1所述的一种水稻的高光效分子育种方法，其特征在于，所述步骤(A)中的PCR引物为：上游:5'
‑
AGGATCCAGCCAGCAGATGGCGAGC
‑
3'下游:5'
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AGAGCTCCGATGAAATCAGGAGGGCAC
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3'。3.根据权利要求2所述的一种水稻的高光效分子育种方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为94℃，2min；94℃，30s；55℃，30s；72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸7min。4.根据权利要求1所述的一种水稻的高光效分子育种方法，其特征在于，所述一次性潮霉素抗性检测装置包括上盒(1)，所述上盒(1)内设有隔板(11)，所述隔板(11)将上盒(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛伟强，王思哲，朱迎婷，任代胜，夏祥华，杨家来，赵艳飞，陶兴武，曹秀敏，
申请(专利权)人：安徽袁粮水稻产业有限公司，
类型：发明
国别省市：