一种人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽与抗体的制备方法技术

一种人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽与抗体的制备方法。C端特异性多肽氨基酸序列为：GVSNIRTLDTPFRKNC。抗人精子膜蛋白SPAG8抗体制备包括：(1)特异性胞外抗原表位的分析与设计；(2)特异性人工多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔多克隆抗体；(5)收集、分离、纯化获得抗体。本发明专利技术制备的特异性抗人精子膜蛋白SPAG8抗体效价高、亲和力强、特异性好，可在体内和体外与具有天然活性的人精子膜蛋白SPAG8抗原表位发生特异性结合，可以用于荧光免疫和酶联免疫吸附实验。该抗体不仅对研究人精子膜蛋白SPAG8蛋白特性、功能、表达谱和相关疾病提供一个重要工具，还在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有应用前景。物制药和精准治疗等领域具有应用前景。物制药和精准治疗等领域具有应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽与抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种多肽及其抗体制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白SPAG8蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。

技术介绍

[0002]我国不孕不育患者高达5000万人，其中10
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30％的男性因特异性精子表面膜抗原激活自身免疫系统，体内产生抗精子抗体(anti
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sperm antibody,AsAb)，出现干扰精子运动、直接或间接杀伤精子、和妨碍精卵融合等生殖生理过程，引发男性不育，由于缺乏精子膜蛋白特异性抗原位点和抗体的研究，AsAb引起男性免疫不育症的作用机制尚未明确，因此借助分子生物学、生物信息学和高通量测序等技术的跨学科应用，进一步揭示精子顶体区、颈部和尾部精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。
[0003](1)SPAG8的功能：人精子膜蛋白SPAG8(sperm
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associated antigen8，SPAG8)基因位于9p13.3 DNA反义链，长度为4,488bp，有9个外显子，已经发现两种mRNA亚型：NM_001039592.1和NM_172312.1。SPAG8蛋白质产物426个氨基酸，分子量44,819Da，分为2个亚型，分别是单次跨膜Ⅱ型膜蛋白和分泌蛋白。SPAG8蛋白广泛分布在细胞质、细胞核、囊泡，和顶体，此外细胞骨架，微管组织中心，有丝分裂纺锤体中也均有分布。成熟的精子细胞中，在头部的顶体区域和尾部的中间部分检测到分布。
[0004](2)SPAG8抗体产品的信息：经检索,市场上有SPAG8蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同且只能进行体外检测。
[0005](3)SPAG8与疾病：精子细胞和圆形精子细胞中SPAG8分布于细胞核和细胞质中，而在变形的精子细胞中，仅在细胞质中表达，不在细胞核中表达。有丝分裂周期，SPAG8定位在微管组织中心(MTOC)。中期延伸到纺锤体微管；后期在星状微管和中间区可以检测到；末期保留在中间区。细胞分裂后，返回到MTOC，由该基因编码的蛋白质位于精子表面。在精子发生中，SPAG8通过增强与环磷酸腺苷反应元件调节因子亚型tau结合共激活因子FHL5并增强FHL5调节tau的转录激活发挥作用，此外，SPAG8参与顶体反应和精子与透明带的结合反应，通过调节有丝分裂所需的CDK1的活化延迟进入分裂期而发挥调节G2/M期进展的作用，SPAG8还可能通过与微管形成中起作用的RANBP9相互作用影响生育。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的针对可用于免疫不育机制研究的AsAb制备方法的不足，提供了一种人精子膜蛋白SPAG8多肽与抗体的制备方法。不同于体外实验检测抗体，用此多肽制备的抗SPAG8抗体一方面可以通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验特异识别组织或细胞中的天然人SPAG8蛋白，另一方面可以借助SPAG8的特异性表面抗原位点进行抗精子抗体介导的免疫不
育作用机制的研究，还可以开展靶向示踪、生物制药和精准治疗等方面的研究。
[0007]本专利技术的技术方案
[0008]一种人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽，抗原结合位点广泛分布于人精子颈部、尾部中段及尾部外膜，多肽序列为人精子膜蛋白SPAG8氨基酸序列中第422位到第437位氨基酸的肽段，多肽的氨基酸序列为：GVSNIRTLDTPFRKNC。
[0009]本专利技术同时提供了一种抗人精子膜蛋白SPAG8的抗体的制备方法，包括：
[0010]第1步、人精子膜蛋白SPAG8特异性抗原表位的分析与设计；
[0011]利用生物信息软件对蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数。
[0012]第1.1步、使用TMHMM在线预测膜蛋白的跨膜区域
[0013]登录TMHMM主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式SPAG8蛋白序列或将序列粘贴在“OR by pasting sequence(s)in FASTA format:”下方的文本框；out format有三个选项，分别是图形输出(Extensive,with gaphics)；文字输出(Extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(One line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
[0014]第1.2步、使用SignalP 4.1Server对膜蛋白进行信号肽的预测分析
[0015]登录SignalP 4.1Server主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置Organism group：选择Eukaryotes；D
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cutoff values：选择Default(optimized for correlation)；Graphics output：选择PNG(inline)；Output format：Standard；Method选择Input sequences may include TM regions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
[0016]第1.3步、使用ExPASY
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ProtScale对膜蛋白进行疏水性的预测分析
[0017]登录ExPASY
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ProtScale主界面，在“Enter a UniProtKB/Swiss
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Prot or UniProtKB/TrEMBL accession number(AC)”文本框内输入蛋白序列ID number；或将FASTA格式蛋白序列粘贴在“Or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“Submit”提交并查看预测分析结果。
[0018]第2步、人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽抗原合成与载体蛋白偶联纯化；
[0019]第2.1步、SPAG8人工多肽的合成
[0020]采用多肽自动合成仪合成纯化，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为95％。
[0021]第2.2步、利用EDC偶联合成多肽
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KLH
[0022]将KLH配制成10mg/ml的溶液，将第2.1步的合成多肽溶解在2.5ml的Imject@EDC Conjugation Bufjfer中，浓度为0.4mg/ml，将多肽溶液滴加入载体蛋白溶液中，用超纯水配制10mg/ml的EDC溶液，立即加250ul此溶液到mcKLH肽溶液，在室温下反应2小时后获得合成多肽
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KLH复合物并除去EDC的残留物。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽，其特征在于抗原结合位点广泛分布于人精子颈部、尾部中段及尾部外膜，多肽的氨基酸序列为：GVSNIRTLDTPFRKNC。2.一种抗人精子膜蛋白SPAG8的抗体制备方法，其特征在于包括：1)、人精子膜蛋白SPAG8特异性抗原表位的分析与设计；2)、人精子膜蛋白SPAG8特异性多肽抗原合成与载体蛋白偶联纯化；3)、制备人工免疫原免疫动物；4)、收集抗体血清；5)、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白SPAG8IgG抗体；6)、酶联免疫吸附实验鉴定血清抗体与天然人SPAG8蛋白结合效价；7)、细胞免疫荧光染色定位精子表面SPAG8蛋白分布。3.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于特异性抗原表位的分析与设计所确定的胞外特异性抗原表位序列为人精子膜蛋白SPAG8氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江，牛远杰，李刚，尚芝群，蒋宁，王准，于健鹏，封玉宏，
申请(专利权)人：天津市泌尿外科研究所，
类型：发明
国别省市：