工程化抗体制造技术

技术编号:31682749 阅读:20 留言:0更新日期:2022-01-01 10:29
本文尤其公开了抗切割抗体和产生抗体的宿主细胞以及用于制备所述抗体、使用所述抗体和改进所述抗体的分泌的方法。和改进所述抗体的分泌的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年3月28日提交的美国临时专利申请号62/825,448的优先权,所述临时专利申请的公开通过援引以其全文并入本文。


[0003]本文尤其提供了具有经修饰的铰链区的抗体,其中相对于具有未经修饰的铰链区的相同抗体,所述抗体对切割更具抗性和/或具有增加的稳定性。

技术介绍

[0004]抗体是结合特定抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠在内的大多数哺乳动物中,抗体是由成对的重多肽链和轻多肽链构建的。每条链由两个不同的区域(称为可变(Fv)区和恒定(Fc)区)组成。轻链和重链Fv区含有分子的抗原结合决定簇,并且负责结合靶抗原。Fc区定义了抗体的类别(或同种型)(例如IgG),并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的生化事件。重链的恒定区可以进一步分为四个更小的结构域,称为:CH1、铰链区、CH2和CH3。恒定区的一部分(即,Fc区)参与许多重要的细胞功能。通常,Fc区被定义为仅包含CH2和CH3,并且还可以涵盖铰链区的一部分。
[0005]IgG同种型的抗体是异常柔性的分子。实际上,IgG的生物学功能需要非常特殊且可控的变形模式。主要负责IgG分子的内部柔性的结构位于恒定区的第一结构域(CH1)与第二结构域(CH2)之间,并且称为铰链区。铰链可以分为三个肽区;分别是上铰链、中铰链和下铰链Brekke等人,1995,Immunol Today[今日免疫学]16:85

90。生化和结构研究指出抗体的铰链区是控制柔性和调节效应子功能的关键结构元件。IgG1 b12的晶体结构(Saphire等人,2001,Science[科学]293:1155

1159和Saphire等人,2002,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志],319(1):9

18)揭示了极端的不对称性,从而指示了抗体内的异常结构域间柔性。b12的结构揭示了铰链的另一种特征,即它的脆性;b12的结构在铰链区显示出广泛的损伤,这与抗体铰链特性的先验知识一致。
[0006]因此,当在宿主细胞中表达重组抗体时,经常在抗体铰链区观察到显著的蛋白水解切割(即,剪切)事件也就不足为奇了。这样的切割使得抗体产生过程效率较低,并且导致功能免疫球蛋白滴度降低。因此,需要用于在产生和纯化过程期间减少宿主细胞表达的抗体的铰链区中蛋白水解剪切的量的改进的组合物和方法。本文公开的主题满足了这些需求,并且还提供了额外的益处。

技术实现思路

[0007]本文尤其提供了在抗体铰链区具有改变的氨基酸序列且在产生和纯化期间具有减少的或没有蛋白酶介导的切割(即,剪切)的非天然存在的工程化单克隆抗体以及产生所述单克隆抗体的方法。当与不含有所公开的改变的铰链区氨基酸序列和/或未根据本文公开的方法使用的抗体相比时,所公开的方法、工程化抗体和重组宿主细胞导致抗体产生和/
或纯化增加。
[0008]因此,在一些方面,本文提供了一种包含铰链区的单克隆IgG1抗体重链多肽,所述铰链区包含减少所述多肽的蛋白水解的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施例中,所述多肽进一步包含IgG1抗体轻链多肽。在本文公开的任何实施例的一些实施例中,所述一个或多个修饰包含在氨基酸位置216、217、222、226和/或234中的一个或多个处的修饰,其中所述氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中的编号进行编号。在一些实施例中,所述修饰包含以下中的一个或多个:216T或V;217T或S;222C、D或E;226N或P;和/或234R。在本文公开的任何实施例的一些实施例中,所述修饰进一步包含在位置227处的修饰。在一些实施例中,所述修饰包含227P。在本文公开的任何实施例的一些实施例中,所述修饰包含在位置216处的修饰以及在氨基酸位置222、226、227和/或234处的一个或多个修饰。在一些实施例中,所述修饰包含216T以及以下中的一个或多个:222C、D或E;226N或P;227P;和/或234R。在本文公开的任何实施例的一些实施例中,所述修饰包含在位置217处的修饰以及在氨基酸位置222、226、227和/或234处的一个或多个修饰。在一些实施例中,所述修饰包含217T以及以下中的一个或多个:222C、D或E;226N或P;227P;和/或234R。在本文公开的任何实施例的一些实施例中,所述修饰是选自由以下组成的组的组合修饰:(a)R217S

T226N;(b)R217S

S222C;(c)T216V

R217S

T226N;(d)S222C

H227P;(e)R217S

S222E

H227P;(f)T216V

R217S

S222C

T226P;(g)T226P

H227P;(h)R217S

S222C

T226P;(i)T216V

S222D

T226P;(j)T216V

S222C

T226P

H227P;(k)T216V

S222E

T226N;(l)T216V

S222C

H227P;(m)R217S

S222C

T226N;(n)S222C

T226P

H227P;(o)T216V

S222C

T226N

H227P;(p)R217S

S222D

T226P

H227P;(q)T216V

H227P;(r)S222E

T226P

H227P;(s)R217S

S222D

T226N

H227P;(t)R217S

S222E

T226P

H227P;(u)T216V

S222C;(v)R217S

S222D;(w)S222E

T226P;(x)R217S

S222C

T226P

H227P;(y)T216V

T226P

H227P;(z)T216V

S222D

H227P;(aa)T226N

H227P;(bb)S222D<本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含铰链区的单克隆IgG1抗体重链多肽,所述铰链区包含减少所述多肽的蛋白水解的一个或多个氨基酸修饰。2.如权利要求1所述的多肽,所述多肽进一步包含IgG1抗体轻链多肽。3.如权利要求1或权利要求2所述的多肽,其中所述一个或多个修饰包含在氨基酸位置216、217、222、226和/或234中的一个或多个处的修饰,其中所述氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中的编号进行编号。4.如权利要求3所述的多肽,其中所述修饰包含以下中的一个或多个:216T或V;217T或S;222C、D或E;226N或P;和/或234R。5.如权利要求1

4中任一项所述的多肽,其中所述修饰进一步包含在位置227处的修饰。6.如权利要求5所述的多肽,其中所述修饰包含227P。7.如权利要求3或4所述的多肽,其中所述修饰包含在位置216处的修饰以及在氨基酸位置222、226、227和/或234处的一个或多个修饰。8.如权利要求7所述的多肽,其中所述修饰包含216T以及以下中的一个或多个:222C、D或E;226N或P;227P;和/或234R。9.如权利要求3或4所述的多肽,其中所述修饰包含在位置217处的修饰以及在氨基酸位置222、226、227和/或234处的一个或多个修饰。10.如权利要求7所述的多肽,其中所述修饰包含217T以及以下中的一个或多个:222C、D或E;226N或P;227P;和/或234R。11.如权利要求1

6中任一项所述的多肽,其中所述修饰是选自由以下组成的组的组合修饰:(a)R217S

T226N;(b)R217S

S222C;(c)T216V

R217S

T226N;(d)S222C

H227P;(e)R217S

S222E

H227P;(f)T216V

R217S

S222C

T226P;(g)T226P

H227P;(h)R217S

S222C

T226P;(i)T216V

S222D

T226P;(j)T216V

S222C

T226P

H227P;(k)T216V

S222E

T226N;(l)T216V

S222C

H227P;(m)R217S

S222C

T226N;(n)S222C

T226P

H227P;(o)T216V

S222C

T226N

H227P;(p)R217S

S222D

T226P

H227P;(q)T216V

H227P;(r)S222E

T226P

H227P;(s)R217S

S222D

T226N

H227P;(t)R217S

S222E

T226P

H227P;(u)T216V

S222C;(v)R217S

S222D;(w)S222E

T226P;(x)R217S

S222C

T226P

H227P;(y)T216V

T226P

H227P;(z)T216V

S222D

H227P;(aa)T226N

H227P;(bb)S222D

T226N

H227P;(cc)R217S

S222E

T226N;(dd)R217S

T226N

H227P;(ee)R217S

S222E

T226N

H227P;(ff)T216V

R217S

H227P;(gg)T216V

S222E

T226P

H227P;(hh)T216V

S222C

T226N;(ii)R217S

T226P

H227P;(jj)T216V

T226P;(kk)S222E

T226N

H227P;(ll)S222E

H227P;(mm)R217S

S222E

T226P;(nn)R217S

T226P;(oo)T216V

S222D;(pp)R217S

S222C

H227P;(qq)T216V

S222E

T226N

H227P;(rr)S222C

T226N

H227P;(ss)T216V

R217S

S222C

T226N

H227P;(tt)R217S

S222D

T226P;以及(uu)S222D

T226N(vv)。12.如权利要求1

11中任一项所述的多肽,其中与不包含所述一个或多个氨基酸修饰的单克隆IgG1抗体重链多肽相比,所述多肽表现出少至少约50%的蛋白水解。13.如权利要求1

12中任一项所述的多肽,其中所述多肽表现出不可检测的蛋白水解。14.如权利要求1

13中任一项所述的多肽,所述多肽进一步包含编码信号序列的多肽。15.如权利要求1

14中任一项所述的多肽,所述多肽进一步包含编码载体蛋白的多肽。
16.如权利要求14或权利要求15所述的多肽,其中编码载体蛋白的所述多肽与编码信号序列的所述多肽相邻。17.如权利要求14

16中任一项所述的多肽,其中所述载体蛋白包含CBH1或其片段。18.如权利要求1

17中任一项所述的多肽,其中所述抗体是抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体、抗埃博拉病毒抗体、抗聚集β

淀粉样蛋白(Aβ)抗体、抗人免疫缺陷病毒(HIV)抗体、抗单纯疱疹病毒(HSV)抗体、抗精子抗体(诸如抗人避孕抗原(HCA)抗体)或抗HER2/neu抗体。19.如权利要求1

18中任一项所述的多肽,其中与不包含所述一个或多个氨基酸修饰的单克隆IgG1抗体重链多肽相比,所述多肽表现出增加的稳定性。20.一种核酸,所述核酸编码如权利要求1

19中任一项所述的融合多肽。21.一种载体,所述载体编码如权利要求20所述的核酸。22.如权利要求21所述的载体,所述载体进一步包含编码启动子的核酸序列。23.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含如权利要求1

19中任一项所述的多肽、如权利要求20所述的核酸或如权利要求21或权利要求22所述的载体。24.如权利要求23所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自由以下组成的组:哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞和真菌宿主细胞。25.如权利要求24所述的宿主细胞,其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。26.如权利要求24所述的宿主细胞,其中所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。27.如权利要求24所述的宿主细胞,其中所述真菌细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。28.如权利要求27所述的宿主细胞,其中所述酵母细胞是酵母属物种(Saccharomyces sp.)。29.如权利要求24或权利要求27所述的宿主细胞,其中所述真菌细胞选自由以下组成的组:木霉属物种(Trichoderma sp.)、青霉属物种(Penicillium sp....

【专利技术属性】
技术研发人员:J
申请(专利权)人:丹尼斯科美国公司
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1