细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片、装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术实施例提供了一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片、装置及方法，在本发明专利技术中，可同时实现对液基样本中的目标细胞进行高通量分选，对分选得到的目标细胞进行原位电穿孔改造，对改造后的细胞进行原位观察及统计分析。本发明专利技术可在15min内实现大规模背景细胞下痕量目标细胞的分选及改造，其中分选效率大于85％，改造效率大于75％，并且可以保证整套流程下细胞的活性大于80％。本发明专利技术提供的细胞高活性分选及改造的方法，一方面通过原位一体化的操作可以减少各步骤间的细胞损失及损伤，保证细胞活性；另一方面通过权衡不同孔径下细胞通过滤孔时的剪切应力和电穿孔过程中的电场强度来设计并优化滤膜孔径，进一步保证细胞的高活性。的高活性。的高活性。

【技术实现步骤摘要】
细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片、装置及方法


[0001]本专利技术涉及生物微机电系统领域，具体涉及一种目标细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片、装置及方法。

技术介绍

[0002]相关技术中，利用一定手段将外源分子(如核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等)导入原核和真核细胞内对细胞进行改造，被证实在细胞示踪及靶向治疗等领域有广泛的应用前景。其中，电穿孔方法由于其同时具有标记效率高和保持细胞高活性的双重优势被广泛应用于细胞相关研究中。
[0003]现有的电穿孔方法中，一种常用的方法是：利用传统平板电极电转杯进行细胞电穿孔，该方法简单且应用成熟，但当数以百万计的细胞聚集在一个小空间里，利用一对电极间的高压脉冲对它们进行冲击时，会降低细胞活性，并且，这种方法随机性较强，不能准确地对目标细胞进行单细胞精准操作。
[0004]另一种常用的方法是：利用纳米孔的电场聚集效应来进行细胞高活性的电穿孔，该方法可实现单细胞水平上细胞的高活性电穿孔，但是一方面该方法需要保证细胞刚好落在纳米孔之上，导致电穿孔通量/效率较低(10％左右)，另一方面受纳米孔尺寸限制，该方法无法同时实现大背景细胞下目标细胞的分离及特异性电穿孔改造。
[0005]因此，目前亟需一种可以同时实现大量背景细胞下目标细胞的高活性分选及改造的方案。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种原位电穿孔法进行细胞的分离和改造的研究，本专利技术实施例一方面可以避免大细胞群体电穿孔过程中的随机性实现单细胞水平上的细胞改造，另一方面可同时实现大量背景细胞下目标细胞的分离及原位的特异性改造，同时保证电穿孔改造后目标细胞的高活性。
[0007]为了解决上述问题，第一方面，本专利技术实施例提供了一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片，所述芯片包括：芯片中间层，芯片上层和芯片下层；
[0008]所述芯片中间层为高孔隙多孔滤膜，所述高孔隙多孔滤膜的膜孔直径小于目标细胞的直径且大于背景细胞的直径，所述高孔隙多孔滤膜用于从大量背景细胞中分离、捕获、定位痕量的目标细胞；
[0009]所述芯片上层和所述芯片下层的结构相同，具体包括：网状电极，所述网状电极集成于所述高孔隙多孔滤膜的两侧，所述网状电极用于对捕获到的目标细胞进行单细胞水平上的电穿孔靶向改造。
[0010]可选地，所述高孔隙多孔滤膜的材料为聚对二甲苯，所述高孔隙多孔滤膜整体的大小范围为1mm2～400mm2；所述高孔隙多孔滤膜的膜孔为六边形膜孔，所述高孔隙多孔滤膜的模孔直径范围是2μm～100μm，孔间距小于10μm。
[0011]可选地，所述芯片上层中的网状电极和所述芯片下层中的网状电极形成所述网状电极对，所述网状电极对连接一外部电脉冲发生器，所述电脉冲发生器向所述网状电极对施加电脉冲。
[0012]可选地，所述网状电极对的电极间距动态可调节，所述电极间距的范围为10μm～2mm。
[0013]可选地，所述网状电极集成于所述高孔隙多孔滤膜的两侧，包括：通过溅射及光刻的微电子加工手段直接集成，或者，通过芯片定位手段间接集成。
[0014]第二方面，本专利技术实施例提供一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔装置，包括：上述第一方面所提供的任意一种原位电穿孔芯片、芯片负载特氟龙夹具、夹具接合磁铁。
[0015]第三方面，本专利技术实施例提供了一种细胞高活性分选及改造的方法，包括：
[0016]将含有目标细胞的液基样本输入至上述第二方面提供的原位电穿孔装置，以利用原位电穿孔芯片捕获所述目标细胞；
[0017]加入电穿孔缓冲液及待导入外源分子，调节合适电极间距，在外部电脉冲发生器和网状电极对的作用下，导入外源分子至目标细胞；
[0018]对携带外源分子的目标细胞进行细胞膜原位恢复培养，实现目标细胞高活性改造。
[0019]本专利技术提出的一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片，可以利用高孔隙多孔滤膜对液基样本进行过滤，由于高孔隙多孔滤膜的膜孔的直径小于目标细胞直径、大于背景细胞直径，因此，在保证细胞高活性的同时，高孔隙多孔滤膜可以从大背景细胞中分离出痕量目标细胞，并且目标细胞落入孔内可实现目标细胞的单细胞层面精准定位。
[0020]在利用高孔隙多孔滤膜实现目标细胞的分选(分离、捕获、定位)之后，直接对分选得到的目标细胞进行膜上原位电穿孔改造，通过对电极间距及电穿孔条件(包括：电场强度、脉冲次数等)的控制，改造后目标细胞活性高，可继续进行原位培养、观察及统计分析。
[0021]本专利技术提供的细胞高活性分选及改造的方法，一方面通过原位一体化的操作可以减少各步骤间的细胞损失及损伤，保证细胞活性；另一方面，由于本专利技术是在单细胞水平上的电穿孔，在电穿孔改造过程中单细胞周围电场分布均匀，对细胞损伤较小，对细胞活性影响小；再一方面本专利技术还可以通过权衡不同孔径下细胞通过滤孔时的剪切应力和电穿孔过程中的电场强度来设计并优化滤膜孔径，可以进一步保证细胞的高活性。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1是本专利技术实施例提供的一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片示意图；
[0024]图2是本专利技术实施例提供的一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔装置；
[0025]图3是本专利技术实施例提供的细胞高活性分选及改造的方法流程图；
[0026]图4是在不同电场强度不同脉冲次数下，利用本专利技术提供的原位电穿孔实现的电穿孔效率和细胞活性示意图。
[0027]图5是通过本专利技术实施例提供的细胞高活性分选及改造的方法处理目标细胞后目标细胞的细胞活性示意图。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]电穿孔是一种将外源性大分子引入细胞或细菌内的方法。其依据是当细胞受一定强度的电脉冲作用时，细胞膜或细胞壁上会可逆地形成纳米级的孔，从而允许大分子进入细胞或引发细胞融合。然而目前相关方法均无法实现单细胞水平上，大背景细胞下目标细胞的定向电穿孔改造。
[0030]在实际应用中，所用到的液基样本中(例如：全血血液)中背景细胞一般为血细胞如白细胞(其物理特性是较小、较软)，所需进行改造的目标细胞一般为痕量循环肿瘤细胞CTC(其物理特性是较大、较硬)。
[0031]基于此，本专利技术提出一种可以实现大量背景细胞下目标细胞的高活性分选及改造的技术构思：
[0032]利用高孔隙多孔滤膜对液基样本进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞高活性分选及改造的原位电穿孔芯片，其特征在于，所述芯片包括：芯片中间层，芯片上层和芯片下层；所述芯片中间层为高孔隙多孔滤膜，所述高孔隙多孔滤膜的膜孔直径小于目标细胞的直径且大于背景细胞的直径，所述高孔隙多孔滤膜用于从大量背景细胞中分离、捕获、定位痕量的目标细胞；所述芯片上层和所述芯片下层的结构相同，具体包括：网状电极，所述网状电极集成于所述高孔隙多孔滤膜的两侧，所述网状电极用于对捕获到的目标细胞在单细胞水平上进行电穿孔靶向改造。2.根据权利要求1所述的原位电穿孔芯片，其特征在于：所述高孔隙多孔滤膜的材料为聚对二甲苯，所述高孔隙多孔滤膜整体的大小范围为1mm2～400mm2；所述高孔隙多孔滤膜的膜孔为六边形膜孔，所述高孔隙多孔滤膜的模孔直径范围是2μm～100μm，孔间距小于10μm。3.根据权利要求1所述的原位电穿孔芯片，其特征在于：所述芯片上层中的网状电极和所述芯片下层中的网状电极形成所述网状电极对，所述网状电极对连接一外部电脉冲发生器，所述电脉冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，浑婷婷，刘姚萍，黄东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：