CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开了一种CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，对含有棉花内源启动子载体进行改造，以PbuCas13b蛋白取代原有的nCas9+Tad蛋白，构建在棉花中具有RNA编辑能力的载体CRISPR/PbuCas13b；选取GhCLA和GhPGF为目标基因验证CRISPR/PbuCas13b在棉花中的应用；设计靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将单碱基编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行qRT

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及一种CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法。

技术介绍

[0002]目前，植物基因编辑一直是植物育种产生高产，优质，抗病，抗虫等优良品种的重要途径。早期的植物基因编辑技术主要利用DNA与蛋白质相互识别的原理研发了锌指核酸酶系统(Zinc finger nucleases，ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶系统(Transcription activator
‑
like effector nucleases，TALENs)。 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑系统由于编辑效率高，操作简单，成本低等优点在其研究开发后，迅速地取代ZFNs和TALENs，成为目前被普遍采用的一种基因编辑技术。CRISPR/Cas9 系统主要由两大部分组成，Cas9蛋白和sgRNA(small guide RNA)。Cas9是有切割作用的蛋白酶，sgRNA由crRNA和tracrRNA(trans
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activating crRNA)组合而成，主要起引导作用，特异性识别和结合靶标DNA。当表达载体构建并于植物体内表达时，sgRNA结合靶标，与sgRNA串联的Cas9蛋白的HNH和RuvC 切割活性域活性被激活，对靶标特异性切割。
[0003]目前植物的基因编辑系统主要是在植物DNA层面上进行编辑，在RNA层面上对植物基因进行编辑的研究还不多。本专利技术选用的Cas13b蛋白为 PbuCas13b，来自于颊普雷沃菌(Prevotella buccae)，其两端没有明显的PFS序列，但据报道该蛋白对于靶标3
’
端UU序列有轻微的偏好性。另外Cas13b蛋白在微调基因方面可能具有更大的应用潜力。
[0004]目前应用于植物的RNA编辑系统主要有RNAi以及CRISPRi。RNAi技术在植物中应用较早且十分广泛，其原理主要是利用植物体自身的防御机制。当外源病毒入侵植株时，植株会识别并产生小干扰RNA(Small interfering RNAsiRNAs)，之后siRNAs和RNA酶形成沉默诱导复合体(RNA
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induced silencingcomplex，RISC)，RISC能寻找同源和互补RNA并降解这些RNA，基于此，本专利技术能用此对特定RNA进行敲除。RNAi的优点是方便快捷，其缺点是RNA 的敲除无法长时间维持并传递给下一代。相较于此，CRISPR/Cas13系统能稳定维持RNA的敲除并遗传给下一代，并且CRISPR/Cas13系统的脱靶率要远低于 RNAi。CRISPRi系统主要是利用失活的Cas9蛋白与转录阻碍复合物的融合蛋白来抑制RNA的转录，通过突变Cas9蛋白切割活性域的某些氨基酸时，能在保持Cas9与sgRNA结合活性的前提下，使Cas9蛋白失去切割活性，本专利技术称之为dCas9。之后，利用转录阻碍复合物，通过设计合理的靶标来将转录阻碍复合物带到特定位置，从而阻止转录来达到敲低RNA的方法。CRISPRi与 CRISPR/Cas13系统都是通过利用Cas蛋白来对RNA进行调控。但CRISPR/Cas13 系统主要通过敲掉RNA来降低RNA，而CRISPRi系统则是通过阻止转录来降低RNA含量。两者各有自身的优势，但在靶标的选择上，CRISPR/Cas13系统是远优于CRISPRi系统的。
[0005]棉花是重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业重要的天然纤维，棉籽油也是重要的油料储备。仅有基因编辑系统是不够的，还需要开发新的可行而又有效的RNA编辑工具，
为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持。
[0006]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0007](1)目前植物的基因编辑系统主要是在植物DNA层面上进行编辑，在RNA层面上对植物基因进行编辑的研究还不多。
[0008](2)RNA的敲低无法长时间维持并传递给下一代。
[0009](3)RNA编辑脱靶率大。
[0010]解决以上问题及缺陷的难度为：RNA编辑脱靶率大的问题是目前RNA编辑存在的主要问题，由于以往RNA编辑技术一直依靠植物内源的防御机制，导致脱靶问题难以解决。
[0011]解决以上问题及缺陷的意义为：为植物RNA编辑技术提供新工具，并能解决RNA编辑无法传递给下一代以及RNA编辑脱靶率大的问题。

技术实现思路

[0012]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法。
[0013]本专利技术是这样实现的，一种CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，所述CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法包括以下步骤：
[0014]步骤一，对含有棉花内源启动子pGhU6
‑
7的7.10nCas9载体进行改造，以PbuCas13b蛋白取代原有的nCas9+Tad蛋白，构建在棉花中具有RNA编辑能力的载体CRISPR/PbuCas13b；
[0015]步骤二，选取GhCLA和GhPGF为目标基因验证CRISPR/PbuCas13b在棉花中的应用；
[0016]步骤三，设计2个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将单碱基编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行qRT
‑
PCR，以jin668为对照，检测CRISPR/PbuCas13b在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率。
[0017]进一步，步骤一中，所述载体CRISPR/PbuCas13b的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述CRISPR/PbuCas13b载体的改造，包括：
[0018](1)基因合成：在NCBI上找到PbuCas13b的目的基因序列，前后加上SalI和MluI两个酶切位点，Amp抗性，克隆到pUC57载体；其中，所述目的序列PbuCas13b的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
[0019](2)质粒提取：使用质粒小提中量试剂盒提取pUC57
‑
PbuCas13b质粒；
[0020](3)酶切：酶切载体为pUC57
‑
PbuCas13b和7.10nCas9；用SalI酶和MluI酶进行酶切；琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察，拍照保存；
[0021](4)T4连接酶切回收后的产物PbuCas13b和已酶切7.10nCas9载体，过夜；热击转化，挑取单克隆，阳检测序验证，得到适用于陆地棉的RNA编辑系统。
[0022]进一步，步骤(1)中，所述目的基因序列的制备，包括：
[0023]①
在如SEQIDNO：2所示的序列PbuCas13b在棉花中进行密码子优化；
[0024本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法包括以下步骤：步骤一，对含有棉花内源启动子pGhU6
‑
7的7.10nCas9载体进行改造，以PbuCas13b蛋白取代原有的nCas9+Tad蛋白，构建在棉花中具有RNA编辑能力的载体CRISPR/PbuCas13b；步骤二，选取GhCLA和GhPGF为目标基因验证CRISPR/PbuCas13b在棉花中的应用；步骤三，设计2个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将单碱基编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行qRT
‑
PCR，以jin668为对照，检测CRISPR/PbuCas13b在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率。2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，步骤一中，所述载体CRISPR/PbuCas13b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CRISPR/PbuCas13b载体的改造，包括：(1)基因合成：在NCBI上找到PbuCas13b的目的基因序列，前后加上SalI和MluI两个酶切位点，Amp抗性，克隆到pUC57载体；其中，所述目的序列PbuCas13b的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；(2)质粒提取：使用质粒小提中量试剂盒提取pUC57
‑
PbuCas13b质粒；(3)酶切：酶切载体为pUC57
‑
PbuCas13b和7.10nCas9；用SalI酶和MluI酶进行酶切；琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察，拍照保存；(4)T4连接酶切回收后的产物PbuCas13b和已酶切7.10nCas9载体，过夜；热击转化，挑取单克隆，阳检测序验证，得到适用于陆地棉的RNA编辑系统。3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，步骤(1)中，所述目的基因序列的制备，包括：
①
在如SEQ ID NO：2所示的序列PbuCas13b在棉花中进行密码子优化；
②
优化后的序列如序列表SEQ ID NO：2，根据序列进行核苷酸合成。4.如权利要求2所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，步骤(3)中，所述pUC57
‑
PbuCas13b需把合成的PbuCas13b酶切下链接到7.10nCas9载体，所述7.10nCas9需把原载体的nCas9序列切下；所述待酶切的PbuCas13b基因和nCas9前后均有SalI和MluI两个单一酶切位点。5.如权利要求2所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶切体系，包括：
①2×
lig buffer 2.5μL；
②
T4 DNA liqase 0.5μL；
③
Vector 1μL；
④
PbuCas13b 1μL。6.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，步骤三中，所述PbuCas13b载体的靶标添加，包括：(1)合成sgRNA模板：合成PbuCas13b crRNA+tRNA模板，并以此为模板扩增单靶标sgRNA，双靶标sgRNA直接合成tRNA+sgRNA+tRNA+sgRNA+tRNA全长；其中，所述sgRNA序列SEQ ID NO：3所示；(2)靶标设计：选择内源基因GhCLA和GhPGF作为验证基因，靶标的长度选择28bp或者
30bp；(3)引物设计：使用primer premier 5.0设计引物，引物长度15
‑
30bp，GC含量在40
‑
60％；(4)sgRNA扩增：分别扩增tRNA+crRNA+gRNA以及gRNA+tRNA，靶标序列为接头；利用重叠延伸PCR技术扩增tRNA+sgRNA+tRNA，双靶标sgRNA本发明直接利用合成模板扩增；(5)酶切载体：StuI和SbfI酶切载体CRISPR/Cas13载体；体系配好后，轻弹，离心混匀，由于两个酶切位点的酶切温度分别为65℃和37℃，则先37℃培养箱4h，后在65℃水浴0.5h，酶切回收；(6)In
‑
fusion连接：将酶切回收后得到的载体与扩增好的PCR产物进行infusion连接，37℃水浴30min，冰上放置5min，
‑
20℃保存备用；(7)热击转化；(8)农杆菌电击转化：Kan
+
、Rif
+
抗性的LB固体培养基平板和LB液体培养基，农杆菌GV3101保存于
‑
70℃，冰盒，SOC，灭过菌的2mL的离心管，电转仪，电转杯，整个过程都是在超净工作台上完成。7.如权利要求6所述的CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，所述酶切体系包括：
①
ddH2O补充至100μL；
②
C...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，邹佳威，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：