甜菜BvCENH3基因单倍体诱导系的构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种甜菜BvCENH3基因单倍体诱导系的构建方法与应用。本发明专利技术的甜菜BvCENH3基因单倍体诱导系的构建方法包括：以含有甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的农杆菌转化甜菜叶柄，制备CENH3基因突变的甜菜植株；其中，甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体为含有靶向甜菜CENH3基因的两个sgRNA的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
型系统组成最为简单，是以Cas9核酸酶以及向导RNA(gRNA)为核心组成。Cas9内切酶在sgRNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination，HR)或者非同源末端链接机制(nonhomologous end jonining，NHEJ)对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过HR机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂DNA缺口，因而会引入一段新的遗传信息；在NHEJ修复过程中，往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。CRISPR技术不仅是基因功能已经的利器，而且可用于基因编辑以改良农作物，建立基因病动物模型和基因治疗。
[0006]由于CRISPR/Cas9系统构建简单、成本低廉，现已成功应用于大肠杆菌，果蝇，小鼠，模式植物拟南芥、烟草以及水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、葡萄、甜橙等作物中。与动物和微生物不同，植物中基于CRISPR/Cas9的基因编辑通常依赖于表达Cas9和sgRNA的构建体的稳定转化，主要使用农杆菌介导的转化方法。由CRISPR/Cas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甜菜BvCENH3基因单倍体诱导系的构建方法，该方法包括：以含有甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的农杆菌转化甜菜叶柄，制备CENH3基因突变的甜菜植株；其中，甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体为含有靶向甜菜CENH3基因的两个sgRNA的CRISPR
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Cas9载体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶向甜菜CENH3基因的两个sgRNA分别具有如下核苷酸序列：sgRNA1：SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，或SEQ ID NO.1的第4
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23位核苷酸组成的序列；sgRNA2：SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，或SEQ ID NO.2的第4
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23位核苷酸组成的序列。3.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括制备含有甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的农杆菌的过程：以甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体转化农杆菌，制备得到含有甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的农杆菌。4.根据权利要求1或3所述的方法，该方法还包括制备甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的过程：将靶向甜菜CENH3基因的两个sgRNA连接到具有卡那抗性的CRISPR
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Cas9上，制备得到甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体；优选地，制备甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体的过程包括：将靶向甜菜CENH3基因的两个sgRNA分别连接到CRISPR
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Cas9和另一空载体上，获得两种连接产物，每种连接产物各含有一个sgRNA；优选地，所述另一空载体为pBWD(LB)DNAi(AT)；将两种连接产物分别用Lgu I酶切，并用T4连接酶连接酶切产物，构建得到甜菜BvCENH3基因双靶标CRISPR/Cas9编辑载体。5.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：将CENH3基因突变的甜菜植株与互补植株进行正反杂交，形成甜菜BvCENH3基因单倍体；其中，所述互补植株为含有以NPTⅡ基因为筛选标记的pBWA(V)K
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EGFP
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴新荣，白晨，孙瑞芬，李晓东，韩平安，唐宽刚，常悦，张自强，王良，张必周，梁亚晖，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：