本发明专利技术提供了c-di-GMP荧光探针，包含(A)光学活性多肽或与其具有至少70％序列相同性并具有光学活性的变体，和(B)c-di-GMP敏感多肽或与其具有至少70％序列相同性并具有c-di-GMP敏感性的变体，其中，A位于B的序列内，将B分为B1和B2两个部分，形成氨基端到羧基端方向上具有B1-A-B2的结构，或一个或多个A位于两个或更多个B之间，通过接头与两端的B连接。本发明专利技术提供的c-di-GMP荧光探针蛋白分子量相对较小且易于表达，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的在细胞和大肠杆菌中进行相关的应用研究，能够高通量、实施、定量检测c-di-GMP。GMP。
【技术实现步骤摘要】
一种环二鸟苷酸光学探针及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及光学探针的
，尤其涉及一种环二鸟苷酸(c-di-GMP)光学探针及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]C-di-GMP(环二鸟苷酸)最初是由Moshe Benziman和他的同事在1987年发现的，他们发现c-di-GMP可以别构激活α-葡萄变形杆菌中的纤维素合成。c-di-GMP已被证明可以调节细菌的生物膜的形成、细菌运动、细菌毒力、细胞周期、分化和其他过程。此外，c-di-GMP还可以作为核糖开关发挥作用。调节细菌中的c-di-GMP信号通路可能是一种控制医疗和工业环境中生物膜形成和扩散的新方法。
[0003]正是由于c-di-GMP具有如此重要的作用，因此准确检测其变化对于研究c-di-GMP介导的信号通路具有重要意义。C-di-GMP的传统检测方法是色谱-质谱-核磁共振波谱连用法：Franziska等人将色谱、质谱、核磁共振三种技术连用对c-di-GMP进行定量分析，从而确定DGC酶催化产生c-di-GMP的含量(Zahringer,Massa et al.2011)；该研究先通过HPLC-MS(高效液相色谱-质谱)连用的技术对纯化的c-di-GMP进行分析鉴定，随后又用1H-NMR(核磁共振波谱)的方法对c-di-GMP进行定量(Zahringer,Massa et al.2011)。能够应用于活细胞或或细菌中的方法目前有RNA探针法、FRET型荧光探针、BRET型荧光探针。Ming C.Hammond等利用RNA适配体GEMM-1/Spinach和DFHBI染料组成了Vc2-Spinach小分子核酸生物传感器，用于检测c-di-GMP和cAMP-GMP(Kellenberger,Wilson et al.2013)。Samuel.Miller等将CFP和YFP与PilZ蛋白融合构建了一种FRET型的c-di-GMP生物传感器，用于研究c-di-GMP对铜绿假单胞菌细胞分裂的影响(Christen,Kulasekara et al.2010)；Zhao-Xun Liang等人将一种青色荧光蛋白mCerulean与黄色荧光蛋白mVenus与MrkH-VCA0042结合蛋白融合构建了一种FRET型生物传感器，用于研究生物膜分散剂或在巨噬细胞的恶劣环境条件下的大肠杆菌中c-di-GMP水平变化(Ho,Chong et al.2013)Ming C.Hammond等应用CSL-BRET(分裂荧光素酶与生物发光共振能量转移)开发了第一个用于c-di-GMP检测的化学发光生物传感器(Dippel,Anderson et al.2018)。
[0004]传统的核磁、色谱方法在活细胞或细菌研究中这些检测方法存在很大的缺陷，需要经过耗时的样品处理过程：细胞或细菌破碎、分离提取纯化等，不能在活细菌和细胞中进行原位、实时、动态、高通量和高时空分辨率的检测。而应用于活细胞或活菌中的RNA方法受到内源性的c-di-GMP干扰，荧光依靠外源添加染料来产生。因此，还需要考虑染料在细菌中的渗透性问题。FRET型探针包括两种荧光蛋白，存在两种蛋白的光谱重叠易干扰，共同表达的效率低和水溶性差等问题。在BRET方法中，荧光素酶Rluc需要外源添加底物才能产生荧光信号，检测方法较为繁琐。此外，体内外广泛存在的c-di-GMP类似物GTP、GDP、ATP、AMP、ADP、NAD
+
、NADP
+
严重影响现有技术中检测方法的准确性。因此，本领域仍需要能在活细胞或活细菌内、外实时原位、定量、准确高效检测c-di-GMP的方法。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种在活细胞或活细菌内、外实时原位、定量、准确高效检测c-di-GMP的方法。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种c-di-GMP光学探针，其是融合蛋白，包含光学活性多肽A或与其具有至少70％序列相同性并具有光学活性的变体，和c-di-GMP敏感多肽B或与其具有至少70％序列相同性并具有c-di-GMP敏感性的变体，
[0008]其中，A位于B的序列内，将B分为B1和B2两个部分，形成氨基端到羧基端方向上具有B1-A-B2的结构，或
[0009]一个或多个A位于两个或更多个B的序列之间，通过接头与两端的B连接，优选地，一个A位于两个B的序列之间，通过接头与两端的B连接，形成氨基端到羧基端方向上具有B-A-B的结构。
[0010]本专利技术提供一种c-di-GMP光学探针，其是具有选自以下序列的融合蛋白，
[0011](I)光学活性多肽A位于c-di-GMP敏感多肽B之间形成的氨基端到羧基端方向上具有B1-A-B2的结构的氨基酸序列，或
[0012]一个或多个光学活性多肽A位于两个或更多个c-di-GMP敏感多肽B之间，通过接头与两端的B连接的序列，和
[0013](II)与(I)有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性并具有检测c-di-GMP的功能的变体。
[0014]在一个实施方案中，c-di-GMP敏感多肽包括c-di-GMP结合蛋白的c-di-GMP结合域。
[0015]在一个实施方案中，所述敏感多肽源自天蓝色链霉菌。在一个实施方案中，所述敏感多肽是c-di-GMP结合蛋白或其具有与c-di-GMP结合功能的片段。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述c-di-GMP结合蛋白是BldD蛋白。
[0017]在一个实施方案中，c-di-GMP敏感多肽具有SEQ ID NO:1所示的序列，或与其有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性并保留c-di-GMP结合功能的变体。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述变体是截短的变体。
[0019]在一个实施方案中，光学活性多肽是荧光蛋白或其功能片段或变体。
[0020]在一个实施方案中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋白(如cpYFP，优选具有SEQ ID NO:2所示序列或与其具有至少70％序列相同性的序列)、绿色荧光蛋白(如cpGFP，优选具有SEQ ID NO:3所示序列或与其具有至少70％序列相同性的序列)、蓝色荧光蛋白(如cpBFP，优选具有SEQ ID NO:4所示序列或与其具有至少70％序列相同性的序列)、红色荧光蛋白(如cpmApple，优选具有SEQ ID NO:5所示序列或与其具有至少70％序列相同性的序列)中任一种或多种。
[0021]在一个实施方案中，荧光蛋白如SEQ ID NO:2-5中任一所示。
[0022]在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含位于其N端和/或C端的其他多肽。在一些实施方案中，其他多肽是将融和蛋白定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。
[0023]在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包含(A)光学活性多肽或与其具有至少70％序列相同性并具有光学活性的变体，和(B)c-di-GMP敏感多肽或与其具有至少70％序列相同性并具有c-di-GMP敏感性的变体，其中，A位于B的序列内，将B分为B1和B2两个部分，形成氨基端到羧基端方向上具有B1-A-B2的结构，或一个或多个A位于两个或更多个B之间，通过接头与两端的B连接，优选地，一个A位于两个B之间，通过接头与两端的B连接，形成氨基端到羧基端方向上具有B-A-B的结构。2.如权利要求1所述的融合蛋白，具有选自以下的一项或多项特征：所述c-di-GMP敏感多肽包括c-di-GMP结合蛋白的c-di-GMP结合域，所述c-di-GMP敏感多肽源自天蓝色链霉菌，所述c-di-GMP敏感多肽是c-di-GMP结合蛋白或其具有与c-di-GMP结合功能的变体，所述c-di-GMP结合蛋白是BldD蛋白，所述融合蛋白还包含侧接所述光学活性多肽A的任一端或两端的一个或多个接头。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，光学活性多肽位于c-di-GMP敏感多肽的选自以下的位置中：氨基酸9-19和/或35-51，优选地，光学活性多肽位于c-di-GMP敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：9/10，10/11，11/12，16/17，17/18，18/19，35/36，36/37，36/38，36/39，36/40，36/41，36/42，37/38，37/39，37/40，37/41，37/42，38/39，38/40，38/41，38/42，39/40，39/41，39/42，40/41，40/42，41/42，42/43，43/44，44/45，45/46，46/47，47/48，48/49，49/50，50/51，或光学活性多肽A位于两个c-di-GMP敏感多肽B之间，通过接头X和Y与两端的B连接，其中，X和...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，赵玉政，张晓倩，陈政达，李写，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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