基于卵泡液蛋白表达作为不明原因复发性流产的预警方法技术

本发明专利技术属于生殖医学领域。技术方案是：本发明专利技术提供的技术方案是：一种基于卵泡液HRG、C4B蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，所述方法非用于疾病诊断治疗；包括如下步骤：1)卵泡液的收集、保存：对收集到的卵泡液在恒温下进行卵冠丘复合物的拾取后将剩余的卵泡液收集，进行1500rpm离心取上清、分装，冻存于

【技术实现步骤摘要】
基于卵泡液蛋白表达作为不明原因复发性流产的预警方法


[0001]本专利技术属于生殖医学领域，具体是一种不明原因复发性流产患者的预警方法。

技术介绍

[0002]在育龄期夫妇中，单次妊娠发生流产的几率大约为15
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25％，并且大多数流产发生于妊娠早期。约有2
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5％的育龄期夫妇会经历2次及以上的流产。通常将3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失称为复发性流产，复发性流产的病因复杂，孕早期复发性流产的常见病因包括遗传因素，解剖结构异常，感染因素，自身免疫疾病、内分泌异常、血栓前状态及环境因素等等。尽管如此，约有一半以上的RSA病例无法得到确切的病因学诊断，被称为不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，由于病因未明，此类病人的个体化治疗及预防流产的再发是目前妇产科学和生殖医学临床工作中的重大难题。
[0003]研究统计显示，再次妊娠发生的流产的风险随着既往流产的次数而增加：初次妊娠的孕妇流产率为11％，而3次及3次以上流产史的妇女，其再次妊娠流产的发生率升高至40％。因此，我国专家建议，连续发生2次流产，其再次出现流产的风险与3次者相近，即应重视并予评估。然而，目前关于不明原因复发性流产的发病机制研究尚不明确，缺乏特异性的治疗手段，并且临床工作中关于复发性流产的再发风险的预判尚缺乏有效的分子标记物及评估体系，因此，研究建立流产发生的预警机制对于RSA患者的处理十分重要。
[0004]随着近年来各类高通量组学技术的发展，蛋白组学、代谢组学等技术在URSA发病机制的探索及分子标记物的寻找中发挥着重要的作用。已有文献报道利用蛋白组学、RNA
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seq及生物信息学分析等技术检测复发性流产患者流产绒毛、蜕膜及子宫内膜组织的蛋白组学改变；但绒毛、蜕膜及子宫内膜组织成分复杂，且大样本的取材收集及验证的困难较大，难以用于临床上对于再妊娠风险的评估。另一方面，血清等体液是作为分子标记物检测的常用样本，近年来已有研究报道，利用iTRAQ蛋白组学和PRM技术及(1)H NMR技术对URSA患者的血清样本进行了蛋白组学、代谢组学的研究，发现了一系列潜在分子标志物。然而，由于女性生殖相关的激素、蛋白等关键因子受月经周期影响较大，血清样本的取样时间难以较好统一，并且其受全身其它系统的影响较大，为后续大样本的验证带来了困难。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服上述
技术介绍
的不足，基于前期不明原因复发性流产患者行IVF的卵泡液蛋白组学研究，及后期扩大样本验证，提供一种基于卵泡液HRG、C4B蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，该种方法应能对URSA患者的妊娠结局有一定的预测价值。
[0006]本专利技术提供的技术方案是：
[0007]一种基于卵泡液HRG、C4B蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，所述方法非用于疾病诊断治疗；包括如下步骤：
[0008]1)卵泡液的收集、保存
[0009]对收集到的卵泡液在恒温下进行卵冠丘复合物的拾取后将剩余的卵泡液收集，进行1500rpm离心取上清、分装，冻存于
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80℃；
[0010]2)C4B、HRG卵泡液蛋白浓度ELISA测定
[0011]采用相应蛋白的ELISA检测试剂盒，对卵泡液进行相应蛋白浓度的检测；
[0012]3)结果统计及分析
[0013]对检测获得的卵泡液ELISA蛋白浓度数据；与URSA患者卵泡液分子标记物的ROC(receiver operator characteristic curve)曲线进行分析比对；
[0014]若检测获得的卵泡液蛋白的HRG浓度<35.80mg/dl时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；或/和，若检测获得的卵泡液蛋白的C4B浓度>2739.7ng/ml时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；
[0015]或者，用同一患者卵泡液蛋白的HRG浓度及C4 B浓度做logistic回归计算获得的预测概率值(predicted probability)作为检验变量，患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制ROC曲线；当患者的预测概率值>0.5816时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低。
[0016]步骤3)中，卵泡液蛋白的HRG浓度<35.80mg/dl，以及卵泡液蛋白的C4B浓度>2739.7ng/ml，分别由HRG浓度的ROC曲线的Cut
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off值以及C4B浓度的ROC曲线的Cut
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off值导出；
[0017]而HRG浓度的ROC曲线以及C4B浓度的ROC曲线，则分别由多个正常对照及URSA患者的卵泡液蛋白HRG浓度以及卵泡液蛋白C4B浓度作为检验变量，对应患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制而成。
[0018]步骤3)中，患者的预测概率值>0.5816(对应的蛋白浓度为HRG<39.84mg/dl,C4B>2374.47ng/ml)，由预测概率值ROC曲线的Cut
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off值导出；预测概率ROC曲线，由多个正常对照样本及URSA患者卵泡液蛋白的HRG浓度及C4B浓度做logistic回归计算获得的预测概率值作为检验变量，对应患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制而成。
[0019]步骤3)中，所述患者的预测概率值>0.5816，对应的蛋白浓度为HRG<39.84mg/dl,C4B>2374.47ng/ml。
[0020]所述分析比对利用GraphPad Prism 7软件进行作图及统计分析，并且利用MedCalc(MedCalc Software Ltd，Belgium)软件进行ROC曲线的绘制及统计分析。
[0021]所述步骤1)卵泡液的收集，取样时间统一为HCG扳机，即LH高峰后36小时，再经阴道取卵术中获得。
[0022]本专利技术的有益效果是：本专利技术利用进行辅助生育的不明原因复发性流产患者的卵泡液作为检测样本，通过TMT蛋白组学及扩大样本ELISA验证，建立了HRG及C4B作为预测再生育风险的分子标记物的体系。主要包括：
[0023]1、本专利技术在样本收集过程中结合了不明原因复发性流产患者的既往病史及本次行辅助生育治疗结局，首次利用TMT技术对不明原因复发性流产再生育未获得正常临床妊娠的患者卵泡液蛋白水平的改变进行蛋白组学对比分析；针对性地筛选了对再生育结局有预测价值的差异蛋白。
[0024]2、首次发现在既往有URSA，本次行IVF/ICSI仍未获得正常妊娠的患者卵泡液中
HRG表达下降、C4B表达上升；在扩大样本进行验证的同时，利用ROC曲线分析，进一步证实了HRG、C4B在卵泡液中的蛋白表达水平对UR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于卵泡液HRG、C4B蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，所述方法非用于疾病诊断治疗；包括如下步骤：1)卵泡液的收集、保存收集到的卵泡液在恒温下进行卵冠丘复合物的拾取后将剩余的卵泡液收集，进行1500rpm离心取上清、分装，冻存于
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80℃；2)C4B、HRG卵泡液蛋白浓度ELISA测定采用相应蛋白的ELISA检测试剂盒，对卵泡液进行相应蛋白浓度的检测；3)结果统计及分析若检测获得的卵泡液蛋白的HRG浓度<35.80mg/dl时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；或/和，若检测获得的卵泡液蛋白的C4B浓度>2739.7ng/ml时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低；或者，用同一患者卵泡液蛋白的HRG浓度及C4 B浓度做logistic回归计算获得的预测概率值作为检验变量，患者本次取卵周期是否获得活产作为状态变量绘制ROC曲线；当患者的预测概率值>0.5816时，患者本次取卵周期能获得活产的概率较低。2.根据权利要求1所述的基于卵泡液HRG、C4B蛋白表达水平作为不明原因复发性流产的预警方法，其特征在于：步骤3)中，卵泡液蛋白的HRG浓度<35.80mg/dl，以及卵泡液蛋白的C4B浓度>2739.7ng/ml，分别由HRG浓度的ROC曲线的Cut
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off值以及C4B浓度的ROC曲线的Cut
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off值导出；而HRG浓度的ROC曲线以及C4B...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙小荷，张银丽，童晓嵋，张松英，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：