一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种d

【技术实现步骤摘要】
一种d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法


[0001]本专利技术属于糖基化位点的分析
，尤其涉及一种d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是最常见的代谢性疾病之一，近年来糖尿病发病率呈上升趋势。这也被称为非酶糖基化。蛋白非酶糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰(PTM)，可导致功能丧失，是糖尿病血管病变的主要发病机制之一。除葡萄糖外，糖尿病患者血液和组织中核糖和果糖含量显著增加，导致α
‑
突触核蛋白、血清和其他细胞蛋白等蛋白发生非酶糖基化。
[0003]对于蛋白质的非酶糖基化，研究最深入的是糖化血红蛋白(Hb)。2010
‑
2011年，美国糖尿病协会(ADA)和世界卫生组织(WHO)推荐糖化血红蛋白(葡萄糖和血红蛋白的加合物)作为糖尿病诊断的新标准。同时，人体内不同的碳水化合物和蛋白质可能发生非酶糖基化，导致蛋白质结构和功能的改变。例如，葡萄糖和核糖被发现与Hb发生非酶糖基化。之前已经确定了Hb中葡萄糖的糖基化位点，包括β
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V1，α
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K16和β
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K66的主要位点，以及这两个亚基中的其他Lys残基。此外，Siddiqui等人还发现，核糖体诱导的Hb糖基化导致了二级和三级结构的紊乱。相反，乙酰水杨酸(ASA，阿司匹林)和对硝基苯甲酸(NBA)能够通过赖氨酸残基乙酰化的机制来阻止Hb的糖基化。
[0004]相比之下，生物体内其他珠蛋白的非酶糖基化，如肌红蛋白研究较少。其除了具有O2储运的生物功能，Mb也可能表现出多种生物功能，如作为一氧化氮(NO)清除剂和低氧亚硝酸还原酶(NIR)，以及过氧化物酶激活H2O2。Mb主要存在于心肌细胞的细胞质、骨骼和肌肉细胞。当这些细胞受损时，Mb可以迅速进入血液循环，并与葡萄糖等碳水化合物发生非酶糖基化作用，导致蛋白质结构和功能的改变。最近，Grune发现，蛋白酶体更倾向于降解葡萄糖修饰的Mb副作用，如d
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核糖与Mb的非酶糖基化。已经证明，核糖通过糖基化引起马心Mb的内部交联。同时，核糖与人Mb(称为HMb)的非酶糖基化还没有报道，HMb的糖基化位点还不清楚。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，该方法首次鉴别出d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，通过UPLC
‑
MS分析d
‑
核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白，确定相应的糖基化肽段，然后对糖基化肽段进行ESI
‑
MS/MS分析，确定糖基化位点，最后用PEAKS Studio软件进行处理，再用PEAKS DB在uniport_homo sapiens数据库中进行搜索，验证糖基化位点。
[0008]优选的，所述d
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核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白经胰蛋白酶酶切。
[0009]优选的，所述胰蛋白酶与d
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核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白的质量比为40～20:0.5～1.5
[0010]优选的，所述胰蛋白酶的酶切条件为36～38℃孵育13～20h。
[0011]优选的，所述糖基化肽段为T3、T8、T14和T21四个肽段。
[0012]优选的，所述UPLC
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MS的色谱条件为：色谱柱为2.1
×
50mm C18反相柱；流动相A为质量浓度0.1％的HCOOH蒸馏水溶液，流动相B为质量浓度0.1％的HCOOH乙腈溶液；流速为0.2mL/min，按0～5min、流动相B：5％，5～45min、流动相B：5％
→
35％，45～50min、流动相B：35％
→
55％；50～55min、流动相B：55％，55～60min、流动相B：5％进行洗脱；进样量为5μL。
[0013]优选的，所述UPLC
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MS分析采用的碎片方式是碰撞诱导解离CID。
[0014]优选的，所述糖基化位点为K34、K56、K87、K147。
[0015]优选的，所述搜索参数为：片段离子质量容限为0.02Da、母离子容限为7ppm；
[0016]设置搜索固定修饰为氨基甲酰基化；
[0017]设置搜索可变修饰为氧化，Met，+15.99Da；脱酰胺化，NQ，+0.98Da；乙酰化，N
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末端，+42.01Da；核糖化，Lys和Arg，+132.04Da；筛选
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10lgP≥20的肽段和
‑
10lgP≥20且含有至少1个唯一肽段的蛋白段。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]本专利技术的鉴别方法以胰蛋白酶为关键剪切酶，获得关键酶切肽段，首次鉴别出d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点。
[0020]本专利技术的鉴别方法准确度高、操作简便、经济适用。
附图说明
[0021]图1d
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核糖对人肌红蛋白的非酶糖基化结构示意图。
[0022]图2HMb与d
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核糖(A)或d
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葡萄糖(B)孵育后的紫外
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可见光谱。
[0023]图3表达和纯化HMb的ESI
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MS谱图。
[0024]图4HMb与d
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核糖或d
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葡萄糖反应不同时间后的ESI
‑
MS光谱图。
[0025]图5经胰蛋白酶酶切的d
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核糖诱导HMb和预期肽片段(T1
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T22)的氨基酸序列。
[0026]图6胰蛋白酶酶切不同时间d
‑
核糖诱导HMb产物的ESI
‑
MS光谱图(A，C)和EICs色谱图(B，D)。
[0027]图7胰蛋白酶酶切不同时间d
‑
核糖诱导HMb产物的ESI
‑
MS光谱图(A，C)和EICs色谱图(B，D)。
[0028]图8肽片段的ESI
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MS/MS质谱图。(箭头标注的是Lys和SO
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Met的位置)。
[0029]图9R
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HMb与H2O2反应30s后的Stopped
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flow光谱图。
[0030]图10HMb或R
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HMb的kobs值与H2O2的线性关系图。
具体实施方式
[0031]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种d
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核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，通过UPLC
‑
MS分析d
‑
核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白，确定相应的糖基化肽段，然后对糖基化肽段进行ESI
‑
MS/MS分析，确定糖基化位点，最后用PEAKS Studio软件进行处理，再用PEAKSDB在uniport_homo sapiens数据库中进行搜索，验证糖基化位点。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述d
‑
核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白经胰蛋白酶酶切。3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述胰蛋白酶与d
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核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白的质量比为40～20:0.5～1.5。4.根据权利要求2或3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的酶切条件为36～38℃孵育13～20h。5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述糖基化肽段为T3、T8、T14和T21四个肽段。6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述UPLC
‑
MS的色谱条件为：色谱柱为2.1
×
50mm C18反相柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婧靖，林英武，肖锡林，高淑琴，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：