BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及多聚体构建技术领域，具体公开了BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用，通过设计并合成串联多聚体引物BmSPI39

【技术实现步骤摘要】
BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及多聚体构建
，具体涉及BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]家蚕(又称桑蚕)是一种绢丝昆虫，属鳞翅目蚕蛾科，具有非常高的经济价值。研究发现，昆虫体内的免疫过程缺乏淋巴细胞及免疫球蛋白的参与，病原微生物在入侵其宿主的过程中会分泌大量的胞外蛋白酶，这些胞外蛋白酶可作为毒力因子来辅助病原微生物对昆虫的入侵过程。为了抵御病原微生物的入侵，宿主生物在一般情况下都会表达高水平的蛋白酶抑制剂，以抵抗病原微生物所分泌的胞外蛋白酶。因此丝氨酸蛋白酶抑制剂在昆虫的免疫系统中占据非常重要的作用。
[0003]从家蚕中共鉴定到了80种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，SPI)，其中包括11种SPI结构域的蛋白酶抑制剂，即Serpin、Kunitz、BPTI、Kazal、TIL等。BmSPI39属于TIL类蛋白酶抑制剂，可通过抑制球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶CDEP
‑
1来防止真菌菌丝穿透家蚕体壁，因此可作为家蚕真菌抗性因子发挥重要的免疫功能。但是研究发现BmSPI39单体形式无抑制活性，且发现BmSPI39多聚体形式虽然具有对枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K的抑制活性，但是目前多聚体化对蛋白酶抑制剂自身活性的影响尚不完全清楚。且发现，现有技术中BmSPI39多聚体活性低、均一性差。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用，利用同尾酶法设计并构建了BmSPI39同型串联多聚体的表达载体，再通过转化、诱导表达、纯化获得BmSPI39同型串联多聚体，能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的活性，且活性更强，表达形式更为均一。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，具体包括如下步骤：
[0006]S1，设计并合成串联多聚体引物BmSPI39
‑
Nde I
‑
BamH I
‑
F、BmSPI39
‑
Not I
‑
R、BmSPI39
‑
Bgl II
‑
R和BmSPI39
‑
L
‑
Bgl II
‑
R，以BmSPI39
‑
p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与T载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，NdeⅠ/BamH
Ⅰ‑
SPI39
‑
NotⅠ、Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
BglⅡ、Nde I/BamH I
‑
SPI39L
‑
BglⅡ；
[0007]所述引物BmSPI39
‑
Nde I
‑
BamH I
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0008]所述引物BmSPI39
‑
Not I
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]所述引物BmSPI39
‑
Bgl II
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0010]所述引物BmSPI39
‑
L
‑
Bgl II
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011]S2，利用Nde I和Not I双酶切，将Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Not I从T载体上切下，连接到p28载体上，成功构建BmSPI39单体的表达载体BmSPI39
‑
monomer；
[0012]S3，同尾酶法(BamH I与BglⅡ互为同尾酶)设计并构建了BmSPI39同型串联多聚体的表达载体；
[0013]所述BmSPI39同型串联多聚体的表达载体包括BmSPI39二聚体、BmSPI39三聚体和BmSPI39四聚体的表达载体；
[0014]S4，将获得的BmSPI39单体的表达载体和BmSPI39同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中，并利用IPTG对其进行诱导表达，然后通过离心收集菌体、超声破碎菌体细胞，离心获得表达有BmSPI39单体蛋白和BmSPI39同型串联多聚体蛋白的菌体上清，然后进行蛋白纯化。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供了由上述所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法制备得到的BmSPI39同型串联多聚体，所述BmSPI39同型串联多聚体包括BmSPI39单体、BmSPI39同型串联二聚体、BmSPI39同型串联三聚体和BmSPI39同型串联四聚体。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供了上述BmSPI39同型串联多聚体在抗真菌中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0018]1、本专利技术通过同尾酶法成功构建了家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI39同型串联多聚体的基础载体，通过SDS
‑
PAGE发现，相较于BmSPI39单体，串联多聚体能看到明显表达，且表达形式为可溶上清，可见串联形式明显提高了丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI39的表达量。
[0019]2、本专利技术获得的BmSPI39同型串联多聚体在BL21(DE3)以及Origami2(DE3)菌株中均以可溶形式进行表达，但活性分析发现在BL21(DE3)中表达的蛋白活性条带更为均一，因此最佳诱导条件为0.2mM，37℃诱导5h，而且纯化得到的BmSPI39串联多聚体蛋白表达量高、更为均一，且无自身多聚化现象，纯化得到的目的蛋白相对纯度达到90％以上，为进一步BmSPI39串联多聚体抗真菌能力研究提供了基础条件，也有利于培育抗真菌转基因家蚕素材，有效推动该类抑制剂的应用研究。
[0020]3、本专利技术构建的BmSPI39串联多聚体蛋白对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K均表现出较强的抑制活性，BmSPI39串联多聚体在BL21(DE3)以及Origami2(DE3)菌株中的表达量均比较高。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1表示本专利技术中BmSPI39串联多聚体载体构建模式图，其中，左半部分为不加Linker组，右半部分加Linker组；
[0023]图2表示本专利技术中BmSPI39串联多聚体的载体片段PCR扩增产物电泳检测，其中，PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，设计并合成串联多聚体引物BmSPI39
‑
Nde I
‑
BamH I
‑
F、BmSPI39
‑
Not I
‑
R、BmSPI39
‑
Bgl II
‑
R和BmSPI39
‑
L
‑
Bgl II
‑
R，以BmSPI39
‑
p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与T载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Not I、Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Bgl
ꢀⅡ
、Nde I/BamH I
‑
SPI39L
‑
Bgl
ꢀⅡ
；所述引物BmSPI39
‑
Nde I
‑
BamH I
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物BmSPI39
‑
Not I
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物BmSPI39
‑
Bgl II
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物BmSPI39
‑
L
‑
Bgl II
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S2，利用Nde I和Not I双酶切，将Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Not I从T载体上切下，连接到p28载体上，成功构建BmSPI39单体的表达载体BmSPI39
‑
monomer；S3，同尾酶法设计并构建了BmSPI39同型串联多聚体的表达载体；所述BmSPI39同型串联多聚体的表达载体包括BmSPI39二聚体、BmSPI39三聚体和BmSPI39四聚体的表达载体；S4，将获得的BmSPI39单体的表达载体和BmSPI39同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中，并利用IPTG对其进行诱导表达，然后通过离心收集菌体、超声破碎菌体细胞，离心获得表达有BmSPI39单体蛋白和BmSPI39同型串联多聚体蛋白的菌体上清，然后进行蛋白纯化。2.如权利要求1所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S2中，所述BmSPI39单体表达载体的构建过程具体为：用限制性核酸内切酶NdeⅠ和NotⅠ分别对NdeⅠ/BamH
Ⅰ‑
SPI39
‑
NotⅠ以及p28载体进行双酶切，在T4连接酶作用下进行连接，获得目的载体Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Not I
‑
p28，即BmSPI39
‑
monomer表达载体，然后将其转化进大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的BmSPI39
‑
monomer质粒，即BmSPI39单体的表达载体。3.如权利要求2所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S3中，所述BmSPI39二聚体表达载体的构建过程具体为：先用Nde I、Bgl
ꢀⅡ
内切酶对前面构建成功的重组T载体Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Bgl
ꢀⅡ
，Nde I/BamH I
‑
SPI39L
‑
Bgl
ꢀⅡ
进行双酶切，再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI39
‑
monomer进行双酶切，然后使用T4 DNA连接酶分别将Nde I/BamH I
‑
SPI39
‑
Bgl
ꢀⅡ
与BmSPI39
‑
monomer以及Nde I/BamH I
‑
SPI39L
‑
Bgl
ꢀⅡ
与BmSPI39
‑
monomer进行连接，连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的质粒BmSPI39
‑
dimer和质粒BmSPI39
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：李游山，杨玺，
申请(专利权)人：陕西理工大学，
类型：发明
国别省市：