一种含多肽标签的重组酶及其在医药化学品合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种含多肽标签的重组酶及其在医药化学品合成中的应用，所述重组酶是将多肽标签连接至腈水解酶氨基酸序列的N端所得到的酶；所述多肽标签的氨基酸序列为GKGKGKGKG。本发明专利技术重组腈水解酶制备1

【技术实现步骤摘要】
一种含多肽标签的重组酶及其在医药化学品合成中的应用
[0001]本申请为“申请号2020112112516，申请日2020年11月3日，名称为多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用”专利申请的分案申请
(一)

[0002]本专利技术涉及一种多肽标签，特别涉及一种可增强腈水解酶等酶可溶性表达的通用多肽标签，及在医药化学品合成中的应用，属于基因工程以及蛋白质工程

(二)
技术介绍

[0003]腈水解酶(EC 3.5.5.1)是一类重要的具有Glu
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Lys
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Cys催化活性中心三联体的水解酶，可在一步反应中有选择地且有效地催化氰基水解为羧基，在有机酸、氨基酸、维生素等化工产品和如加巴喷丁、氯吡格雷、巴氯芬、阿托伐他汀等医药化学品的合成中具有广泛的应用。
[0004]迄今为止，已经报道了许多提高蛋白质可溶性表达水平的有效方法，一种是构建重组周质渗漏菌株或共表达周质伴侣蛋白，另一种是添加融合标签(也称为融合伴侣或溶解性标签)进行协同表达。但这些方法或多或少的存在一些缺陷。如多肽标签上氨基酸的选择、序列的长度可能对重组酶的酶活，稳定性，溶解度或选择性有很大副作用，某些标签甚至会改变酶蛋白的结构导致酶完全失去活性。对于不同的酶的结构和蛋白整体在催化体系中的带电属性，不同的多肽标签的引入会带来不同的效果，需要结合动力学模拟、同源建模等技术进行协助标签的设计。但是有效的多肽标签的优点之一是和目的基因连接后表达并不需要去除即可发挥酶蛋白的作用。其中，Sun
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Ki Kim开发了一种新的聚阴离子多肽标签，显著提高了南极假丝酵母脂肪酶的表达水平和细胞外转运效率。此外，Han等人开发了一种新的融合标签[HE
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MBP(Pyr)]以提高重组蛋白在大肠杆菌中的溶解度，研究表明目的蛋白(如单克隆抗体，抗原蛋白和聚合蛋白)溶解度有不同程度的改善。
[0005]在生物合成方法中，涉及到生物催化的过程通常都是使用全细胞催化剂(湿细胞)来进行的。一般认为产酶发酵中发酵液的体积酶活为比酶活和可溶性表达水平两者的结合。若能在不影响原始特性的前提下，提高酶的比酶活或有效蛋白质的数量将促进全细胞催化性能的进一步提高。所以，增加腈水解酶在大肠杆菌中的溶解度是有巨大意义的。然而增加大肠杆菌所产酶的溶解度是总是以牺牲活力为代价的。因此，在不降低催化水平的情况下合理地增加腈水解酶的溶解度是实现加巴喷丁中间体1
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氰基环己基乙酸(1
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CA)的高效生产仍需进一步研究。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种多肽标签、含多肽标签的重组酶及其在医药化学品合成中的应用，所述多肽标签能够使含多肽标签的重组酶的全细胞催化剂活力和热稳定性均得到有效提升。解决酶热稳定性差，酶活不满足工业大规模应用等问题。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种多肽标签，所述多肽标签两端的氨基酸均为不带电的甘氨酸(G)，其余为甘氨酸(G)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)中任意一种或多种的随机组合；所述多肽标签的长度为5－11个氨基酸。
[0009]进一步，所述多肽标签氨基酸序列为下列之一：GKGKG、GKGEG、GKGHG、GRGRG、GRGGG、GHGHG、GDGDG、GDGEG、GDGRG、GDGKG、GEGEG、GEGKG、GEGGG、GEGRG、GEGDG、GKGKG、GKGDG、GKGEG、GKGGG、GKGHG、GKGRG、GRGRG、GRGDG、GRGEG、GRGKG、GRGGG、GGGKG、GGGEG、GHGHG、GKGKGKG、GKGKGKGKG、GKGKGKGKGKG。
[0010]进一步，优选所述多肽标签两端和中间位置均为不带电的甘氨酸(G)，其余为甘氨酸(G)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)中任意一种或多种的随机组合，更优选构成具有回文元素的氨基酸序列。
[0011]进一步，所述多肽标签还设有连接肽，所述连接肽氨基酸序列为下列之一：GS、GGS、GGGS、GGGGS。
[0012]更进一步，优选多肽标签为GKGKG。
[0013]本专利技术提供一种含所述多肽标签的重组酶，所述酶包含腈水解酶，脂肪酶，脱酰基酶。
[0014]进一步，所述重组酶优选为重组腈水解酶，所述重组腈水解酶是将腈水解酶氨基酸序列的N端与多肽标签连接获得的。所述连接可以采用PCR扩增、一步克隆等方法，例如以含腈水解酶基因的载体(优选pET
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28b(+)/AcN
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M)为模板，设计含多肽标签的引物，经PCR扩增，获得含多肽标签的腈水解酶。
[0015]进一步，所述多肽标签通过连接肽与腈水解酶连接的方式为下列之一：GKGKG
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GS、GKGKG
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GGS、GKGKG
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GGGS、GKGKG
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GGGGS。
[0016]本专利技术所述腈水解酶基因克隆自敏捷食酸菌(Acidovorax facilis ZJB09122)，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0017]本专利技术还涉及含有所述多肽标签的重组酶编码基因的重组质粒(优选重组腈水解酶编码基因的重组质粒)，所述重组质粒以pET
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28b(+)为载体构建，具体为：以含有所述重组酶基因的质粒作为模板，设计含多肽标签的引物，进行全质粒PCR，核酸凝胶电泳和测序进行验证，最终得到重组质粒。
[0018]本专利技术还提供一种由所述含多肽标签的重组酶编码基因构建的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是将含多肽标签的重组酶编码基因的载体pET
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28b(+)，导入宿主菌构建而成；所述宿主菌优选为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0019]本专利技术还提供一种所述含多肽标签的重组酶在制备加巴喷丁中间体1
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氰基环已基乙酸中的应用，所述的应用为：以含多肽标签的重组酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体纯化后的纯酶为催化剂(优选重组腈水解酶)，以1
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氰基环己基乙腈(1
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CN)为底物，以0.2M、pH＝7.0的Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液为反应介质构成转化体系，35℃、200rpm恒温水浴反应完全，获得含1
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氰基环己基乙酸(1
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CA)的转化液，转化液分离纯化，获得1
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氰基环己基乙酸；所述1
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氰基环己基乙酸经过后续加氢等步骤获得加巴喷丁；所述转化体系中，底物加入终浓度为1
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2M，催化剂加入量以湿菌体重量计为50g/L。
[0020]进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含多肽标签的重组酶，其特征在于所述重组酶是将多肽标签连接至腈水解酶氨基酸序列的N端所得到的酶；所述多肽标签的氨基酸序列为GKGKGKGKG。2.如权利要求1所述含多肽标签的重组酶，其特征在于所述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。3.一种含权利要求1所述多肽标签的重组酶的编码基因构建的重组基因工程菌。4.一种含权利要求1所述多肽标签的重组酶在制备加巴喷丁中间体1
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氰基环已基乙酸中的应用，其特征在于所述的应用为：以含多肽标签的重组腈水解酶的编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体纯化后的纯酶为催化剂，以1
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氰基环己基乙腈为底物，以0.2M、pH＝7.0的Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液为反应介质构成转化体系，35℃、200rpm恒温水浴反应完全，获得含1
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氰基环己基乙酸的转化液，转化液分离纯化，获得1
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氰基环己基乙酸；所述转化体系中，底物加入终浓度为1
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2M，催化剂加入量以湿菌体重量计为50g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，谢冬，熊能，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：