一种新型高效增强体液免疫应答和粘膜免疫应答的维甲酸纳米乳佐剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新型高效增强体液免疫应答和粘膜免疫应答的维甲酸纳米乳佐剂及其制备方法和应用，所述维甲酸纳米乳佐剂由维甲酸、油相、表面活性剂、助表面活性剂和水相组成，其中维甲酸被形成的水包油型纳米乳佐剂体系包裹。本发明专利技术提供的维甲酸纳米乳佐剂可以分别与多种抗原(模式抗原OVA、金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原、新冠病毒重组蛋白抗原)共递送，经注射免疫后能增强疫苗抗原的免疫应答水平，具有良好的免疫保护效果，不仅可以诱导系统体液免疫应答，还可高效激活粘膜部位(肠道粘膜，阴道粘膜，肺粘膜，胃粘膜，鼻粘膜)的免疫应答，具极大的市场应用价值和广阔的应用前景。极大的市场应用价值和广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新型高效增强体液免疫应答和粘膜免疫应答的维甲酸纳米乳佐剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种新型高效增强体液免疫应答和粘膜免疫应答的维甲酸纳米乳佐剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]粘膜作为阻断病原体入侵的第一道防线，广泛分布于人体的呼吸、消化、泌尿、生殖系统，在保护人类健康的过程中起到不可替代的作用。粘膜若不能有效阻断病原体，其湿润、脆弱的结构会成为病原体理想的温床，许多重要的器官都将直接暴露在病原体的威胁之下。由粘膜部位感染人体的病原，如霍乱弧菌、沙门氏菌、轮状病毒等，一直以来严重威胁着人类健康。接种疫苗是预防和控制病原体感染的重要手段，然而系统性免疫与粘膜免疫间存在着生理屏障，通过肌肉注射的疫苗往往只能诱导系统性免疫应答，并不能在粘膜部位建立有效的免疫保护屏障，从而难以在粘膜部位阻断病原体的感染，严重阻碍了该类疫苗的推广应用。如何有效高效激活粘膜免疫应答已经成为了疫苗研究者急需解决的关键科学问题。
[0003]近年来，维甲酸(Retinoic acid，RA)在粘膜免疫应答中的重要作用与机制被揭示：它可以通过调节α4β7整合素、细胞因子CCR9、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、乳铁蛋白等多种途径诱导淋巴细胞向肠道归巢，同时促进Ig类型的转化，在肠粘膜提高分泌型sIgA 的水平。然而，RA水溶性弱，且光稳定性差，严重制约了其在佐剂方面的应用。公开号为 CN108324938A的中国专利公开了利用全反式维甲酸制备颗粒型佐剂，可激活体液免疫和肠黏膜免疫应答，但未见阴道粘膜，肺粘膜，胃粘膜，鼻粘膜的免疫应答效果。纳米乳剂可极大提高难溶性药物的溶解度、促进药物吸收、增强药物稳定性，提高生物利用度，但国内外未见维甲酸纳米乳佐剂报道。

技术实现思路

[0004]纳米乳佐剂是一种高度热动学稳定的胶体分散体系，可溶解并递送水溶性弱的药物。同时，乳剂佐剂与抗原共递送可增强系统免疫保护应答，如MF59乳剂，已被作为人用疫苗佐剂上市多年，其安全性、有效性已得到临床广泛认可。根据乳剂佐剂这两个特性，在前期处方筛选实验的基础上，我们设计了以溶解有维甲酸的角鲨烯、GTCC和IPM为油相，Tween 类为表面活性剂、Span
‑
80/Span
‑
85为助表面活性剂的类MF59(MF59
‑
like)水包油型维甲酸纳米乳佐剂(atRA
‑
NE)，通过肌肉注射的方式与重组蛋白抗原共递送，发现其可同时引发特异性系统体液免疫应答与粘膜免疫应答，为粘膜入侵病原体疫苗的设计提供了新思路。
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种维甲酸纳米乳佐剂；本专利技术的目的之二在于提供一种所述的维甲酸纳米乳佐剂的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供一种含有所述的维甲酸纳米乳佐剂的疫苗；本专利技术的目的之四在于提供一种维甲酸纳米乳佐剂在作为疫苗佐剂中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、一种维甲酸纳米乳佐剂
[0008]包含下述重量份的组分：维甲酸0.01
‑
5份，表面活性剂1
‑
30份，助表面活性剂0.1
‑
10份，油相0.1
‑
10份，水44
‑
97.9份。
[0009]优选的，所述表面活性剂为吐温
‑
20、吐温
‑
60、吐温
‑
80、吐温
‑
85、聚氧乙烯蓖麻油或聚氧乙烯氢化蓖麻油中任一种或多种组合。
[0010]优选的，所述助表面活性剂为司盘
‑
80、司盘
‑
85、无水乙醇、丙二醇、甘油、1，3
‑
丁醇中任一种或多种组合。
[0011]优选的，所述油相为乙酸乙酯、角鲨烷、角鲨烯或油酸乙酯中任一种或多种组合。
[0012]优选的，包含下述重量份的组分：维甲酸6份，角鲨烯5份、吐温
‑
80 30份、司盘
‑
80 15 份、水44份。
[0013]优选的，所述维甲酸纳米乳佐剂的粒径分布在1～100nm之间，分散指数小于0.3，Zeta 电位绝对值小于30mV。
[0014]2、所述维甲酸纳米乳佐剂的制备方法
[0015]包含如下步骤：按比例称取维甲酸、表面活性剂、助表面活性剂、油相和水；将维甲酸充分溶解于油相中，再滴加表面活性剂、助表面活性剂，最后边搅拌边缓慢滴加灭菌纯水，得维甲酸纳米乳佐剂。含有所述维甲酸纳米乳佐剂的疫苗
[0016]3、含有所述的维甲酸纳米乳佐剂的疫苗
[0017]所述疫苗抗原为模式抗原OVA、金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原HI以及新冠病毒疫苗重组蛋白抗原RBD。
[0018]4、所述维甲酸纳米乳佐剂在制备疫苗佐剂中的应用，所述佐剂为激活系统体液免疫应答佐剂或粘膜免疫佐剂。
[0019]优选的，所述粘膜为肠道粘膜，阴道粘膜，肺粘膜，胃粘膜，鼻粘膜。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术公开了本专利技术公开了一种高效增强体液免疫应答和粘膜免疫应答的维甲酸纳米乳佐剂及其制备方法和应用，所述维甲酸纳米乳佐剂由维甲酸、油相、表面活性剂、助表面活性剂和水相组成，其中维甲酸被形成的水包油型纳米乳佐剂体系包裹。其结构完整、稳定、均一性好，其粒径分布在10～100nm之间，该尺寸有利于制剂在短时间内向淋巴结聚集，从而有利于被APC识别和递呈，增强免疫应答。
[0022]本专利技术提供的维甲酸纳米乳佐剂可以分别与多种抗原(模式抗原OVA、金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原、新冠病毒重组蛋白抗原)共递送，经注射免疫后可增强疫苗抗原的免疫应答水平，具有良好的免疫保护效果，在肌注给药后，注射部位IL
‑
6与IL
‑
15在注射部位的高表达有助于免疫应答的产生。
[0023]血清IgG的结果显示，atRA
‑
NE诱导了与铝佐剂相当的IgG水平，而其肠粘膜、阴道粘膜，肺粘膜，胃粘膜，鼻粘膜等粘膜部位的sIgA的水平显著高于铝佐剂组，证实其有效激活了系统体液免疫应答的同时，还表现出了显著的粘膜佐剂的特性，具极大的市场应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
[0024]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0025]图1为atRA
‑
NE的理化性质鉴定图(a：粒径分布图；b：Zeta电位分布图；c：扫描电镜图；d：透射电镜图)；
[0026]图2为纳米乳佐稳定性实验(a：离心前；b：离心后)；
[0027]图3为流式细胞仪检测到的细胞表面标记物数据(a)和CCR9基因表达水平(b)(“*”表示相对于空白对照，P<0.05，“**”表示相对于空白对照，P&lt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维甲酸纳米乳佐剂，其特征在于，包含下述重量份的组分：维甲酸0.01
‑
5份，表面活性剂1
‑
30份，助表面活性剂0.1
‑
10份，油相0.1
‑
10份，水相44
‑
97.9份。2.根据权利要求1所述的维甲酸纳米乳佐剂，其特征在于：所述表面活性剂为吐温
‑
20、吐温
‑
60、吐温
‑
80、吐温
‑
85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或聚氧乙烯蓖麻油中任一种或多种组合。3.根据权利要求1所述的维甲酸纳米乳佐剂，其特征在于：所述助表面活性剂为司盘
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80、司盘
‑
85、无水乙醇、丙二醇、甘油或1，3
‑
丁醇中任一种或多种组合。4.根据权利要求1所述的维甲酸纳米乳佐剂，其特征在于：所述油相为乙酸乙酯、角鲨烷、角鲨烯或油酸乙酯中任一种或多种组合。5.根据权利要求1～4任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海波，孙红武，金喆，邹全明，冒灵，刘畅，刘婧怡，曾浩，薛若怡，冯壤，李郭成，金滋力，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：