用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对RGMA蛋白质的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对RGM A蛋白质的单克隆抗体。本申请描述了用于在视网膜神经纤维层(RNFL)变性治疗中使用的RGM A结合蛋白，特别是单克隆抗体，且特别是其CDR移植、人源化形式，其具有与RGM A结合且阻止RGM蛋白质与RGM A受体和其他RGM A结合蛋白结合的能力，并且因此中和RGM A的功能，以及描述了针对RNFL变性在治疗或预防上治疗哺乳动物的方法。或预防上治疗哺乳动物的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对RGM A蛋白质的单克隆抗体
[0001]本申请是国际申请日为2010年12月8日的国际申请PCT/EP2010/069120进入中国、申请号为201080055275.5的题为“用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对RGM A蛋白质的单克隆抗体”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本申请描述了用于在视网膜神经纤维层变性（RNFL）治疗中使用的RGM A结合蛋白，特别是单克隆抗体，且特别是其CDR移植、人源化形式，其具有与RGM A结合且阻止RGM蛋白质与RGM A受体和其他RGM A结合蛋白结合的能力，并且因此中和RGM A的功能，以及针对RNFL变性在治疗或预防上治疗哺乳动物的方法。

技术介绍

[0003]在哺乳动物中枢神经系统（CNS）内的损伤、炎症攻击或神经变性疾病后的轴突再生几乎一直是不可能的；结果取决于在CNS中的神经纤维再生长的固有能力和在CNS内定位于病损或损害部位的微环境中的抑制因子之间的平衡，所述抑制因子活跃阻止再生长，并且因此阻止受损纤维束的再生。
[0004]已确定由少突胶质细胞生成的CNS髓磷脂和病损瘢痕是关于在损伤早期中轴突生长的最相关的不允许结构，通过在体外以及在体内促使生长锥坍塌和神经突生长抑制，从而导致轴突再生长的直接抑制。RGM蛋白质，在CNS髓磷脂和瘢痕组织上的主要抑制因子已得到鉴定（Monnier等人，Nature 419：392
–
395，2002；Schwab等人，Arch. Neurol. 62：1561
–
8，2005a；Schwab等人Eur. J. Neurosci. 21：1569
–
76，2005 b；Hata等人J. Cell Biol.173：47
–
58，2006；关于综述，参见：Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361：1513
–
29，2006；Yamashita等人Curr. Opin. Neurobiol. 17：29
–
34，2007）。RGM蛋白质在死于脑外伤或缺血损伤的人中的损害或病损部位处是上调的（Schwab等人，Arch. Neurol. 62：1561
–
8，2005a），并且在具有脊髓损伤的大鼠中的病损部位处是上调的（Schwab等人Eur. J. Neurosci. 21：1569
–
76，2005 b；Hata等人J. Cell Biol.173：47
–
58，2006，关于综述参见：Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361：1513
–
29，2006；Yamashita等人Curr. Opin. Neurobiol. 17：29
–
34，2007）。此外，使用来自多发性硬化患者和健康人的临床样品的第一手数据暗示人RGM A在患有MS的患者的脑脊髓液中是上调的（数据未显示）。
[0005]为了评估RGM A特异性多克隆抗体的再生促进潜力，在中重度脊髓损伤模型中施用抗体，其中在胸椎水平9/10的约60％脊髓被横切。组织学检查揭示此类病损切断皮质脊髓束的所有背侧和外侧纤维。经由泵局部给予2周的RGM A特异性多克隆抗体诱导受损神经纤维的长距离再生（Hata等人，J. Cell Biol. 173：47
–
58，2006）。
[0006]数百根神经纤维延伸经过病损部位，并且最长的纤维再生超出病损多过10 mm，而在对照抗体处理的动物中未发现病损远侧的再生纤维。与对照抗体处理的、脊柱受损的大
鼠比较，抗RGM A处理的大鼠的功能恢复得到显著改善，从而证明RGM A是有力的神经再生抑制剂和用于在特征在于轴突损害或神经纤维损伤的适应症中刺激恢复的有价值靶（Hata等人，J. Cell Biol. 173：47
–
58，2006；Kyoto等人Brain Res. 1186：74
–
86，2007）。此外，用功能阻断多克隆抗体中和RGM A蛋白质不仅刺激在脊柱受损大鼠中损害神经纤维的再生长，还增强其突触形成，从而使得能够再形成或恢复损害神经元回路（Kyoto等人Brain Res. 1186：74
–
86，2007）。
[0007]rgm基因家族涵盖3种不同基因，其中2种，rgm a和b在CNS产生RGM A和RGM B蛋白质的哺乳动物中表达，而第三个成员，rgm c在外周中表达（Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361：1513
–
29，2006），其中RGM C在铁代谢中起重要作用。在体外，RGM A通过与Neogenin结合抑制神经突长出，所述Neogenin已鉴定为RGM受体（Rajagopalan等人Nat Cell Biol.：6（8），756
–
62，2004）。Neogenin首先被描述为netrin结合蛋白（Keino
‑
Masu等人Cell，87（2）：175
–
85，1996）。这是重要发现，因为Netrin
‑
1与Neogenin或其紧密相关受体DCC（在结肠直肠癌中是缺失的）的结合已报道为刺激而不是抑制神经突生长（Braisted等人J. Neurosci. 20：5792
–
801，2000）。阻断RGM A因此通过使得Neogenin能够结合其神经突生长刺激配体Netrin而释放RGM介导的生长抑制。基于这些观察，中和RGM A可以假定为在人脊髓损伤的模型中优于中和Neogenin。除RGM A与Neogenin结合和诱导神经突生长抑制外，RGM A或B与骨形态发生蛋白BMP
‑
2和BMP
‑
4的结合可以代表关于成功神经再生和功能恢复的另一个障碍（Mueller等人，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361：1513
–
29，2006）。
[0008]RNFL是视网膜的最内层，并且主要由来自组成视神经的神经节细胞神经元的轴突组成。在RNFL内的轴突直到它们经过眼的筛板才是有髓的。RNFL的这个结构特征使得它成为检查在CNS内的神经变性过程的理想组织，因为RNFL厚度反映轴突的贡献，而无髓磷脂变性的潜在结构效应（Frohman等人，Arch. Neurol. 65（1）：26
–
35，2008）（还参见图19）。
[0009]Fris
é
n，L.和Hoyl，W.F.首次报道了在具有多发性硬化（MS）的患者中RNFL的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于在视网膜神经纤维层（RNFL）变性治疗中使用的对于人RGM A的结合蛋白。2.用于如权利要求1中定义使用的结合蛋白，其中所述治疗是治疗或预防、神经再生或神经保护、局部或全身性治疗。3.用于如权利要求1或2中定义使用的结合蛋白，其中作为所述治疗的结果a）观察到视网膜神经元萌芽；和/或b）在视网膜中的RGC（视网膜神经节细胞）轴突保护免于变性。4.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其中所述RNFL变性与选自下述的疾病相关：糖尿病视网膜病、缺血性视神经病、X染色体连锁视网膜劈裂症、药物造成的视神经病、视网膜营养不良、年龄相关的黄斑变性、特征在于视神经乳头玻璃疣的眼病、特征在于光感受器变性的遗传决定子的眼病、常染色体隐性遗传视锥视杆营养不良、和线粒体病症伴视神经病。5.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其以1 x 10
‑
7 M或更少的K
D
和1 x 10
‑
2 s
‑1或更少的k
off
速率常数与人RGM A解离，两者都通过表面等离振子共振测定。6.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，如在标准体外测定中测定的，其与人RGM A结合且中和人RGM A的神经突长出抑制活性。7.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其为人源化抗体。8.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其包含抗原结合结构域，所述结合蛋白能够结合RGM分子的表位，所述抗原结合结构域包含选自下述的至少一个CDR：a）由SEQ ID NO：59和65组成的CDR
‑
H3组氨基酸序列，和与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列；和/或b）由SEQ ID NO：62和68组成的CDR
‑
L3组氨基酸序列，和与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。9.用于如前述权利要求之一中定义使用的结合蛋白，其进一步包含选自下述的至少一个CDR：a）由SEQ ID NO：57和63组成的CDR
‑
H1组的氨基酸序列；和/或b）由SEQ ID NO：60和66组成的CDR
‑
L1组的氨基酸序列；和/或c）由SEQ ID NO：58和64组成的CDR
‑
H2组的氨基酸序列；和/或d）由SEQ ID NO：61和67组成的CDR
‑
L2组的氨基酸序列；和与所述序列之一具有至少50 ％序列同一性的修饰的CDR氨基酸序列。10.用于如权利要求9中定义使用的结合蛋白，其包含选自由下述组成的可变结构域CDR组的至少3个CDRs：VH5F9组VH5F9CDR
‑
H1SEQIDNO.:34的残基31
‑
35SEQIDNO:57VH5F9CDR
‑
H2SEQIDNO.:34的残基50
‑
66SEQIDNO:58VH5F9CDR
‑
H3SEQIDNO.:34的残基99
‑
104SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：ABBVIE德国有限责任两合公司，
类型：发明
国别省市：