本发明专利技术涉及用于从细胞培养收获物中纯化免疫球蛋白的新方法。这些方法的特征在于在初始捕获色谱步骤之前的清洗步骤。优选地，初始捕获色谱为亲和色谱，并且通过絮凝和过滤获得捕获前的澄清效果。通过使用此类预捕获的澄清步骤，实现了从捕获基质洗脱的免疫球蛋白的改进的质量。此外，细胞培养液的更澄清导致亲和色谱过程中的沉淀减少，由此增加了昂贵的亲和树脂的寿命。这是以大规模生产的免疫球蛋白纯化的重要改善。本发明专利技术进一步涉及捕获色谱下游的连续精制色谱和过滤步骤，产生高纯度的免疫球蛋白。球蛋白。球蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过使用捕获前的絮凝改善免疫球蛋白的亲和色谱
专利
[0001]本专利技术涉及用于防止来自细胞培养物衍生的成分在抗体的亲和色谱过程中沉淀的方法，该方法使用在亲和捕获色谱之前的絮凝和过滤步骤以及在捕获步骤之后的进一步精制步骤以纯化抗体来进行。
[0002]专利技术背景
[0003]选择用于纯化重组DNA技术产生的多肽的高效且经济的下游工序是开发预期用于治疗用途的每种新生物药物的关键步骤。近来，由于单克隆抗体(mab)在医疗应用中具有极高的治疗剂量，因此对单克隆抗体(mab)的大规模纯化方法的需求随着改进的细胞培养方法的应用得到进一步加强，所述改进的细胞培养方法导致更高的细胞密度、更高的表达率和由此更高的滴度，例如大于10g/L的目标重组抗体。产品和污染物在培养液中的浓度不断增加对捕获色谱、在其之前的样品澄清步骤以及随后的精制色谱提出了更高的要求。整个下游工艺必须：(i)管理增加的产品量，(ii)有效去除增加的工艺相关和产品相关的杂质，使其低于规定的可接受标准，(iii)维持经济产量，以及(iv)确保足够的mab质量。通常，下游工艺占治疗性抗体的总制造成本的主要部分。
[0004]通常，粗流分中的mab与杂质相关，例如宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HCDNA)、内毒素、胰岛素、病毒、聚集物、其他不期望的产物变体和来自加工材料的各种浸出液。这些杂质的存在是患者的潜在健康风险，因此使其从终产品中消失是监管机构的要求。仅容许极低的残留量。
[0005]纯化细胞培养物衍生的多肽的典型方法遵循捕获
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中间
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精制色谱的顺序，并伴随着在下游工序不同位置的过滤、浓缩或透析步骤。近年来，平台方法已在mab纯化领域成功建立。由于mab是一类定义明确的糖蛋白，具有共同的物理化学特性，因此使用通用平台方法是合理的(Kelly B 2009)。这种具有或多或少的产品特异性调整的通用方法可以应用于许多mab，特别是对于相同类别或亚类的那些免疫球蛋白，例如IgG1或IgG2。
[0006]mab纯化中最常用的捕获步骤之一为使用蛋白质A的亲和色谱。这种捕获为带有Fc的分子提供了卓越的选择性，从而在单一步骤中去除了99.5％以上的污染物。但是，除它的优点之外，还应该提到两个缺点。一个缺点在于不期望的蛋白质A或蛋白质A片段的浸出，它们已知是有毒性的(Gagnon P 1996)。另一个缺点在于这种类型的树脂成本高，特别是在工业规模上纯化足够量治疗性抗体时所必需。蛋白质A树脂比离子交换树脂贵约30倍。据计算，对于10m3细胞培养物的下游处理，蛋白质A亲和色谱的成本约为400万
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500万美元(Farid SS 2009)。
[0007]在许多情况下，捕获步骤使用粗的输入(上样)材料进行，这会导致亲和柱树脂的污染(杂质蓄积)。在没有适当的再生步骤存在时，这会妨碍捕获树脂的成功再利用。粗培养液中的污染物，如脂质、氧化剂、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HCDNA)、聚集物或颗粒、金属离子和其他物质会促进树脂结垢，并在低pH洗脱期间产生沉淀和混浊(Shukla AA 2005)。除了对结合部分的直接影响外，基质也可被不可逆地污染。结果是增加了反压力并降低每次运行的容量和流速。这个问题不限于蛋白质A树脂：色谱树脂在其使用寿命内的结
垢是商业生物制品分离的普遍重大问题。用于疏水相互作用色谱和混合模式色谱的疏水配体在用作细胞培养衍生的免疫球蛋白的捕获步骤时，特别容易从培养液中捕获亲脂性污染物。尽管对运行后的清洗步骤存在复杂的方案，但捕获柱的寿命是有限的并且取决于循环次数、运行和清洗的操作条件以及样品的组成和纯度。
[0008]为了澄清和预清洗严重污染的培养液，已采用机械分离步骤去除大部分细胞碎片和聚集物。离心和过滤处理是在将样品加载到捕获树脂之前进行的最常见的预处理步骤。对于大体积，通过使用细胞分离器进行连续离心，然后使用深层过滤器和/或微孔过滤器进行过滤步骤。然后将所得培养液称作“澄清的细胞培养物上清液”(Liu HF 2010)。尽管将收获的培养液直接加载到蛋白质A树脂上是一种常见方法的选择(Fahrner RL 2001)，但其他平台技术利用了各种澄清步骤，即离心、深层过滤和/或微孔过滤(Liu HF 2010、WO9522389、WO2001150110)以保护捕获柱。这减少了固体和颗粒对树脂的污染，并改善了捕获洗脱液中抗体的纯度。除了离心/过滤步骤外，以流穿(flow
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through)模式进行的捕获前的色谱已成功证明可用于免疫球蛋白的大规模纯化(WO2015135884)。已经发现，通过在捕获色谱上游加入额外的阴离子交换色谱步骤，可以显著降低纯化过程的总费用。捕获前的阴离子交换流穿色谱步骤减少了成本密集型捕获色谱材料暴露于杂质的负担。
[0009]在用蛋白质A色谱通过酸性pH洗脱mab期间，混浊的洗脱池和高的柱反压力是常见的。研究将这种现象与由蛋白质自缔合导致的液
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液相分离联系起来。多种因素，包括pH、温度、离子强度和蛋白质浓度都会影响这种效果。在蛋白质A洗脱过程中谨慎选择工艺参数，包括温度、流速、缓冲液和盐，可以降低浊度和柱反压力(Luo H 2017)。已经采取了类似的策略来避免聚集和颗粒形成的问题，这些问题体现在蛋白质A洗脱池中的浊度(Shukla AA 2005)。建议将稳定物质(如盐、尿素和氨基酸)添加到洗脱缓冲液中，降低温度，调整洗涤和洗脱缓冲液的pH值，或对细胞培养收获物进行预处理以去除某些可能在低pH下沉淀的杂质。预处理方法包括阴离子交换色谱、过滤和污染物的酸沉淀(Shukla AA2005)。
[0010]絮凝是一种在化学和食品工业以及废水处理中广泛实施的方法。沉淀和絮凝都成功地用于使细胞培养液澄清。沉淀依赖于降低目标溶质的溶解度以产生固体颗粒，但絮凝是由絮凝剂诱导的桥接效应引起的颗粒(哺乳动物细胞培养物中的细胞、细胞碎片或胶体)的聚集。絮凝剂通过使分散的颗粒粘附成较大尺寸的簇来触发生物胶体悬浮液的不稳定，从而导致平均粒径分布的增加。(Felo M2015，Singh N 2016)。絮凝方法可分为阴离子絮凝、阳离子絮凝和混合模式絮凝(Singh N 2016)。
[0011]具体地，已经评估了絮凝剂，例如简单的酸、二价阳离子、聚阳离子聚合物、辛酸和刺激响应聚合物，它们增强细胞培养物的澄清和降低DNA、宿主细胞蛋白(HCP)和病毒水平的能力(Felo M 2015)。大约十年以来，絮凝方法也因其在单克隆抗体的大规模生产中的有用性而得到深入研究。
[0012]在细胞存在下，无论是否调节pH，使用各种阳离子和阴离子的组合进行絮凝已成功应用于单克隆抗体的纯化(WO2007035283)。最优选Ca
2+
和磷酸根的组合。强调了与非絮凝对照相比，蛋白质A洗脱峰中HCP和浊度的显著降低。
[0013]其他方法利用聚电解质，例如聚乙烯磺酸、聚乙烯磺酸盐、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚赖本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于在来自细胞培养液的免疫球蛋白的捕获亲和色谱过程中防止沉淀的方法，该方法包含按以下顺序的下列步骤：(a)将诱导絮凝的化合物添加至细胞培养液中；(b)深层过滤步骤(a)的混合物；(c)将步骤(b)中获得的滤液暴露于亲和色谱，其中免疫球蛋白与亲和色谱介质结合；(d)使用具有pH值为5
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9且离子强度为0.1
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5.0mol/l的洗涤缓冲液洗涤亲和色谱介质；和(e)使用具有pH值为2.5
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4.5的洗脱缓冲液从亲和色谱树脂上洗脱免疫球蛋白。2.权利要求1的方法，其中步骤(a)包含下列步骤：(a1)离心和/或过滤细胞培养液；(a2)向步骤(a1)中获得的上清液或滤液中加入诱导絮凝的化合物。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中诱导絮凝的化合物为阳离子化合物。4.权利要求3的方法，其中阳离子化合物选自二价金属离子盐、水溶性有机聚合物和水不溶性有机聚合物。5.权利要求4的方法，其中二价金属离子盐为CaCl2。6.权利要求4的方法，其中水不溶性有机聚合物为壳聚糖。7.权利要求4的方法，其中水溶性有机聚合物为聚(二烯丙基二甲基氯化铵)。8.权利要求7的方法，其中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)具有10kDa至10000kDa的分子量。9.权利要求7或8的方法，其中添加聚(二烯丙基二甲基氯化铵)的终浓度为0.01
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1.0％(w/v),优选终浓度为0.02
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0.1％(w/v)，更优选终浓度为0.03
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0.08％(w/v)。10.权利要求7
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9的方法，其中除聚(二烯丙基二甲基氯化铵)外，不添加其他用于进行絮凝的物质。11.权利要求7
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10的方法，其中使用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)进行絮凝时无需进一步调节pH或电导率。12.上述权利要求任一项的方法，其中絮凝在室温在搅拌下进行至少5min，优选至少15min。13.上述权利要求任一项的方法，其中亲和色谱为蛋白质A色谱。14.权利要求13的方法，其中蛋白质A色谱介质包含耐碱的蛋白质A衍生物作为配体，优选碱稳定的蛋白质A的结构域B的四聚体变体，其结合至交联的琼脂糖基质。15.上述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)中用于深层过滤的过滤器包含一个以上的层，优选两层。16.上述权利要求任一项的方法，其中在步骤(b)与(c)之间进行微孔过滤。17.上述权利要求任一项的方法，其中在步骤(b)之后至多8小时、优选在步骤(b)之后至多3小时进行步骤(c)。18.上述权利要求任一项的方法，其中细胞培...
【专利技术属性】
技术研发人员：Z，
申请(专利权)人：吉瑞工厂，
类型：发明
国别省市：
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