基于金属钛离子亲和色谱的核酸-蛋白复合物提取方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸

【技术实现步骤摘要】
基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法


[0001]本专利技术涉及核酸结合蛋白领域，具体是涉及一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法。

技术介绍

[0002]核酸结合蛋白(NABPs)既是基因表达的产物，又是基因表达过程中的调节者，它们在复制、转录和翻译水平上发挥着重要作用，从而决定细胞的命运和功能(Hentze,Castello et al.2018)。NABPs的异常表达与癌症在内的许多疾病的发生和发展密切相关，如肺癌(Shang,Qian et al.2018)、乳腺癌(Neelamraju,Gonzalez
‑
Perez et al.2018)、胶质瘤(Wang,Tang et al.2020)以及口腔癌(Weisse,Rosemann et al.2020)等。
[0003]NABPs包括RNA结合蛋白(RBPs)和DNA结合蛋白(DBPs)。近年来，DBPs和RBPs之间的界限日益模糊，比如一些蛋白质可以同时结合DNA和RNA来促进三维基因组中的相互作用。因此，全面绘制核酸结合蛋白质组(NABPome)图谱可以揭示生物过程中和病理情况下核酸
‑
蛋白相互作用网络。
[0004]目前对NABPs的分离主要依赖不同的纳米材料(包括一维纳米碳纳米管和二维纳米石墨烯)。利用纳米材料与核酸之间的之间强π
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π堆叠作用吸附核酸从而富集NABPs。但其缺点在于分离NABPs的选择性很低，分别只有12％和42％，因此导致了不能全面地分析鉴定NABPome。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法。
[0006]本专利技术采用Ti
4+
‑
IMAC用于富集核酸及交联至其上的核酸结合蛋白，核酸结合蛋白被甲醛交联至核酸上，原本应该在上相的RNA迁移至中间相，再用异丙醇沉淀中间相和有机相得到核酸
‑
蛋白复合物。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]本专利技术涉及一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]S1、收集对数生长期细胞，用甲醛交联；加入甘氨酸淬灭交联，然后离心收集细胞；
[0010]S2、用Trizol裂解S1所得的细胞；再加入氯仿分相；在中间相和有机相中加入异丙醇后离心，将细胞膜、脂质小分子去除，离心得到沉淀即为核酸
‑
蛋白复合物的粗提物；
[0011]S3、利用Ti
4+
‑
IMAC与核酸上磷酸基团之间的相互作用捕获核酸
‑
蛋白复合物，在碱性环境中洗脱；
[0012]S4、将步骤S3得到的核酸
‑
蛋白复合物解交联后，对得到的核酸结合相关蛋白进行蛋白质组学分析。
[0013]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S1中，所述甲醛交联的交联条件为4
‑
37℃，终浓
度0.1
‑
1.0％，1
‑
30分钟。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，所述甲醛交联的交联条件为37℃，0.1
‑
1.0％终浓度，10分钟。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S2中，所述Trizol和氯仿的体积比为1：1
‑
10：1。
[0016]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S2中，所述异丙醇的加入量为中间相和有机相总体积的1
‑
9倍。
[0017]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S2中，所述离心的温度为4
‑
20℃，离心的离心力为10000
‑
20000g，离心的时间为5
‑
30分钟。
[0018]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S2中，所述离心的温度为4℃，离心的离心力为12000g，离心的时间为10分钟。
[0019]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S3中，所述捕获的步骤包括：将沉淀物充分溶解在SDS中；再按照核酸和Ti
4+
‑
IMAC质量比为1：10
‑
1：60的比例加入Ti
4+
‑
IMAC，震荡孵育30min
‑
2h后，洗涤，再采用10000
‑
20000g的离心力离心5
‑
30min，弃去上清液即可。
[0020]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S3中，所述捕获的步骤包括：用移液器吸头反复吹吸沉淀物，使之充分溶解在SDS中；再按照核酸和Ti
4+
‑
IMAC质量比为1：10
‑
1：60的比例加入Ti
4+
‑
IMAC，震荡孵育30min
‑
2h后，洗涤液洗两次，再采用10000
‑
20000g的离心力离心5
‑
30min，弃去上清液即可。
[0021]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S3中，所述捕获的步骤包括：用移液器吸头反复吹吸沉淀物，使之充分溶解在SDS中；再按照核酸和Ti
4+
‑
IMAC质量比为1：10
‑
1：60的比例加入Ti
4+
‑
IMAC，震荡孵育1h后，洗涤液洗两次，再采用12000g的离心力离心5min，弃去上清液即可。
[0022]作为本专利技术的一个实施方案，所述SDS的体积浓度为0.05
‑
0.5％。
[0023]本专利技术选择SDS的体积浓度为0.05
‑
0.5％，若SDS的体积浓度小于0.05％，则使得Ti
4+
‑
IMAC同时吸附磷酸化蛋白和核酸(DNA)，带来非特异性吸附；若SDS的体积浓度大于0.5％，则会使得Ti
4+
‑
IMAC几乎不吸附核酸(DNA)。
[0024]作为本专利技术的一个实施方案，所述洗涤采用的洗涤液为50
‑
500mM NaCl,10
‑
100mM Tris
‑
Cl,0.2
‑
1.0mM EDTA和0.1％
‑
1％NP
‑
40的混合液。其中，0.1％
‑
1％NP
‑
40是指以洗涤液的总体积为计，NP
‑
40的体积浓度为0.1％
‑
1％。
[0025]作为本专利技术的一个实施方案，所述洗涤液为100mM NaCl,20mM Tris
‑
Cl,0.5mM EDTA和0.5％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、收集对数生长期细胞，用甲醛交联；加入甘氨酸淬灭交联，然后离心收集细胞；S2、用Trizol裂解S1所得的细胞；再加入氯仿分相；在中间相和有机相中加入异丙醇后离心，将细胞膜、脂质小分子去除，离心得到沉淀即为核酸
‑
蛋白复合物的粗提物；S3、利用Ti
4+
‑
IMAC与核酸上磷酸基团之间的相互作用捕获核酸
‑
蛋白复合物，在碱性环境中洗脱；S4、将步骤S3得到的核酸
‑
蛋白复合物解交联后，对得到的核酸结合相关蛋白进行蛋白质组学分析。2.根据权利要求1所述金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述甲醛交联的交联条件为4
‑
37℃，终浓度0.1
‑
1.0％，1
‑
30分钟。3.根据权利要求1所述金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述Trizol和氯仿的体积比为1：1
‑
10：1。4.根据权利要求1所述金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述异丙醇的加入量为中间相和有机相总体积的1
‑
9倍。5.根据权利要求1所述金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心的温度为4
‑
20℃，离心的离心力为10000
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20000g，离心的时间为5
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖华，王惠雨，张岩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：