一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，具体包括以下步骤：S1、收集有治疗前组织标本，S2、血液样本处理，S3、cfDNA提取，S4、测定浓度，检测片段大小，S5、混合离心，S6、ddPCR检测阶段，S7、荧光信号的读取，S8、数值结果分析，本发明专利技术涉及分子诊断基因检测技术领域。该用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，过和内参基因β

【技术实现步骤摘要】
一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法


[0001]本专利技术涉及分子诊断基因检测
，具体为一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法。

技术介绍

[0002]目前临床结直肠癌基因检测基本上取材于肿瘤组织，但是组织获取为有创性操作，难以在同一例病人无法反复多次进行，特别是对于晚期病人，取材就更加困难。这就意味着在组织标本丢失、不足或疾病进展而活检困难时无法准确的为患者制定个体化的治疗方案，这也限制了原发性耐药及继发性耐药的分子机制研究。因此，临床上探讨适用范围广、痛苦小、准确度高、成本低的基因检测方法显得至关重要。
[0003]ctDNA基因检测是一项非侵入式检测肿瘤的“液体活检”技术，相对于传统的组织活检简单、易行、高重复性，更易被患者接受。在满足两者对mCRC患者突变基因检测结果一致性较好的前提下，有望成为替代组织活检的新的检测方式。
[0004]针对之一问题，本专利技术提供了一种检测方法，通过采用提取结直肠癌患者的外周血，分离血浆，提取游离核酸，检测转移性结直肠癌(mCRC)患者血浆ctDNA中RAS(KRAS、NRAS)、PIK3CA、BRAF基因突变状态，KRAS突变主要定位在第12、13、61和63号密码子，其中有7个突变热点：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg和Gly13Asp共7类热点突变，占KRAS基因总突变的90％以上。作为ras家族的一员，NRAS在结构和功能上都与KRAS具有很多相似性，在非KRAS基因exon2突变的结直肠癌患者中，NRAS基因突变占7.5％(48/641)。NRAS基因有7种常见突变。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF都是EGFR下游的信号分子，是众多信号通路上关键的激活因子。这些基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中的突变率分别为20～50％、1～6％、10～30％、8～15％。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变一般会使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，可替代有创伤性的肿瘤组织活检，ctDNA获取容易，更易被患者接受，ctDNA是肿瘤细胞通过凋亡、坏死或者自分泌的形式释放至外周血的游离DNA,其携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织具有良好的一致性，能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，具体包括以下步骤：
[0009]S1、收集有治疗前组织标本的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因检测结果的mCRC患者若干例，分别包括若干例患者未接受过任何治疗，若干例患者接受了原发灶姑息性切除手术，若干例患者接受过一线以上化疗，肿瘤组织标本基因检测采用Amoy
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Dx试剂盒；
[0010]S2、血液样本处理：获得血液后，在4h内处理做以下处理：取外周血10mL，1600g，4℃离心10min，分离为血浆和血细胞，血细胞于
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80℃保存，将上清液，即血浆，进行第二次离心，16000g，4℃离心10min，移取上清液转并移至保存管中，置于
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80℃保存备用，即血浆样本。
[0011]S3、cfDNA提取：采用核酸提取纯化试剂盒进行cfDNA提取；
[0012]S4、采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小；
[0013]S5、PCR反应体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区；
[0014]S6、ddPCR检测阶段：该阶段在ddPCR检测区完成，首先制备微滴，再PCR扩增，然后将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测，微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析；
[0015]S7、荧光信号的读取；
[0016]S8、数值结果分析：收集首次或正在接受西妥昔单抗治疗的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF野生型mCRC患者若干例，检测治疗前或疗效评估时血浆ctNDA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、基因状态。
[0017]优选的，所述步骤S3中核酸提取纯化试剂盒选用重鼎ZD
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YL
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Midi
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40试剂盒。
[0018]优选的，所述步骤S3中cfDNA提取的具体步骤如下：
[0019]A1、取10mL离心管，加入20μL Proteinase K，再加入2mL“1.血液样本处理”收集的血浆样本，加入2mL溶液GH，漩涡混合15s，然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min；
[0020]A2、上述混合液中加入2mL异丙醇，充分漩涡混合；然后，置于4℃冰箱中孵育10min，将混合液移入套有收集管的中量离心柱，10000rpm离心1min，弃去收集管中废液；
[0021]A3、向步骤A2、的离心柱中加入2.5mL溶液W1A，10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回，其中，溶液W1A按照说明书要求加入无水乙醇；
[0022]A4、向步骤A3的离心柱中加入4mL溶液W2，10000rpm离心3min，去除废液，其中，溶液W2按照说明书要求加入无水乙醇；
[0023]A5、向步骤A4的离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，使残余乙醇挥发；
[0024]A6、向离心柱中加入提前预热的TE溶液450μL，室温静置5min后，10000rpm离心3min；
[0025]A7、弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5
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10min；
[0026]A8、取含有收集管微量离心柱，将700μL步骤A7的混匀液移入微量离心柱中，封盖13000rpm离心30s，弃废液，重复操作，直至混匀液全部过柱；
[0027]A9、13000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇；
[0028]A10、将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入43μL溶液NFwater，室温静置5min后13000rpm离心2min，其中，溶液NF water可50～60℃预热，提高洗脱效率；
[0029]A11、将离心下来的溶液重新移入离心柱内，将离心柱放在离心管中，开盖室温静
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、收集有治疗前组织标本的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因检测结果的mCRC患者若干例，分别包括若干例患者未接受过任何治疗，若干例患者接受了原发灶姑息性切除手术，若干例患者接受过一线以上化疗，肿瘤组织标本基因检测采用Amoy
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Dx试剂盒；S2、血液样本处理：获得血液后，在4h内处理做以下处理：取外周血10mL，1600g，4℃离心10min，分离为血浆和血细胞，血细胞于
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80℃保存，将上清液，即血浆，进行第二次离心，16000g，4℃离心10min，移取上清液转并移至保存管中，置于
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80℃保存备用，即血浆样本。S3、cfDNA提取：采用核酸提取纯化试剂盒进行cfDNA提取；S4、采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小；S5、PCR反应体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区；S6、ddPCR检测阶段：该阶段在ddPCR检测区完成，首先制备微滴，再PCR扩增，然后将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测，微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析；S7、荧光信号的读取；S8、数值结果分析：收集首次或正在接受西妥昔单抗治疗的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF野生型mCRC患者若干例，检测治疗前或疗效评估时血浆ctNDA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、基因状态。2.根据权利要求1所述的一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中核酸提取纯化试剂盒选用重鼎ZD
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40试剂盒。3.根据权利要求1所述的一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中cfDNA提取的具体步骤如下：A1、取10mL离心管，加入20μL Proteinase K，再加入2mL“1.血液样本处理”收集的血浆样本，加入2mL溶液GH，漩涡混合15s，然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min；A2、上述混合液中加入2mL异丙醇，充分漩涡混合；然后，置于4℃冰箱中孵育10min，将混合液移入套有收集管的中量离心柱，10000rpm离心1min，弃去收集管中废液；A3、向步骤A2、的离心柱中加入2.5mL溶液W1A，10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回，其中，溶液W1A按照说明书要求加入无水乙醇；A4、向步骤A3的离心柱中加入4mL溶液W2，10000rpm离心3min，去除废液，其中，溶液W2按照说明书要求加入无水乙醇；A5、向步骤A4的离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，使残余乙醇挥发；A6、向离心柱中加入提前预热的TE溶液450μL，室温静置5min后，10000rpm离心3min；A7、弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5
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10min；A8、取含有收集管微量离心柱，将700μL步骤A7的混匀液移入微量离心柱中，封盖13000rpm离心30s，弃废液，重复操作，直至混匀液全部过柱；A9、13000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇；
A10、将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入43μL溶液NFwater，室温静置5min后13000rpm离心2min，其中，溶液NF water可50～60℃预热，提高洗脱效率；A11、将离心下来的溶液重...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄必胜，胡咏武，
申请(专利权)人：优葆优保健康科技宁波有限公司，
类型：发明
国别省市：