一种靶向PD-L1胞外片段的DNA适配体制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向PD

【技术实现步骤摘要】
SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(PD
‑
L1
‑
Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途，前期利用crisp
‑
9技术构建了PDL1基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选PD
‑
L1阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的。
[0006]采用在基于指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术基础上，我们自主改进的(Whole
‑
Cell SELEX，WCS)技术，利用前期构建的阴性选择细胞系PDL
‑1‑
KO癌细胞系，经大约20
‑
30轮循环，筛选出特异性高、结合紧密的Aptamer。

技术实现思路

[0007](一)解决的技术问题
[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶向PD
‑
L1胞外片段的DNA适配体，通过以细胞表面表达的PDL
‑
1蛋白为靶点，采用whole
‑
cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(PD
‑
L1
‑
Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。
[0009](二)技术方案
[0010]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种靶向PD
‑
L1胞外片段的DNA适配体，该适配体是通过采用Whole
‑
Cell SELEX，WCS技术筛选方法筛选出的核酸适配体PD
‑
L1
‑
Aptamer，利用前期构建的阴性选择细胞系PDL
‑1‑
KO癌细胞系，经20
‑
30轮循环，筛选出特异性高、结合紧密的PD
‑
L1
‑
Aptamer。
[0011]所述Whole
‑
Cell SELEX，WCS技术筛选方法具体包括以下步骤：
[0012]S1、设计并合成一个含52个随机序列的核酸库(initial oligonucleotide pool)，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；
[0013]S2、将步骤S1设计的随机核酸库与目标生物靶点孵育(incubation)，形成核酸适配体
‑
靶点复合体；
[0014]S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子通过合适的方法分离(partitioning)；
[0015]S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增(amplification)，形成一个富集的次级核酸库(enriched sub
‑
pool)，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；
[0016]S5、经过8
‑
20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析(sequencing)，鉴定特异性核酸适配体序列；
[0017]S6、为消除非特异核酸分子与靶点的结合，在SELEX过程中引入几轮负向筛选(counter
‑
selection)，即采用本专利技术前期构建的PD
‑
L1
‑
KO细胞系，将会显著提将筛选得到的PCR产物克隆到质粒中，通过采用构建的PD
‑
L1
‑
KO细胞系，随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，然后与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子；
[0018]S7、将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，确定PDL
‑
1Aptamer与肿瘤细胞的亲和力；
[0019]S8、研究筛选出来的PD
‑
L1
‑
Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用，将筛选出来的PD
‑
L1
‑
Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系与NK细胞混合培养，观察其对肿瘤细胞的影响，分析其作为靶向治疗的潜力，或将其改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法，如治疗性核酸适配体、核酸适配体偶联药物(aptamer
‑
drug conjugates，AptDC)、核酸适配体靶向的纳米药物、核酸适配体介导的免疫治疗。
[0020]优选的，所述步骤S1中DNA适配体序列具体如下：
[0021]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 1 consisting of 52 bases.
[0022]cagcttccaaacgctgattttaagtccaaccgacaatcactacctcgggtgt
[0023]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 2 consisting of 52 bases.
[0024]ccaacttgagggaatttatattacgaaataaaggattgcgggataccaaagg
[0025]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 3 consisting of 52 bases.
[0026]gcgcgtagttggtgcacgaccgacttgccgatatattctggtcacggcggag
[0027]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 4 consisting of 52 bases.
[0028]gtcaataaaagcgtcaattgtaagcgatgttcgttgtgtacactcaatgaga
[0029]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 5 consisting of 52 bases.
[0030]tcggcaatacccttgcgtcgtgcgagactaattctgctgtgttcattaaacc
[0031]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 6 consisting of 52 bases.
[0032]gtgttgagacattgccgacttagagcgcacgcgctcatgttcccgtttaaag
[0033]>PD
‑
L1
‑
Aptamer 7 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向PD
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L1胞外片段的DNA适配体，其特征在于：该适配体是通过采用Whole
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Cell SELEX，WCS技术筛选方法筛选出的核酸适配体PD
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L1
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Aptamer，利用前期构建的阴性选择细胞系PDL
‑1‑
KO癌细胞系，经20
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30轮循环，筛选出特异性高、结合紧密的PD
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L1
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Aptamer；所述Whole
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Cell SELEX，WCS技术筛选方法具体包括以下步骤：S1、设计并合成一个含52个随机序列的核酸库，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；S2、将步骤S1设计的随机核酸库与目标生物靶点孵育，形成核酸适配体
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靶点复合体；S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子通过合适的方法分离；S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增，形成一个富集的次级核酸库，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；S5、经过8
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20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析，鉴定特异性核酸适配体序列；S6、通过采用构建的PD
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L1
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KO细胞系，随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，然后与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子；S7、将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，确定PDL
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1Aptamer与肿瘤细胞的亲和力；S8、研究筛选出来的PD
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L1
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Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用，将筛选出来的PD
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L1
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Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系与NK细胞混合培养，观察其对肿瘤细胞的影响，分析其作为靶向治疗的潜力，或将其改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法。2.根据权利要求1所述的一种靶向PD
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L1胞外片段的DNA适配体，其特征在于：所述步骤S1中DNA适配体序列具体如下：>PD
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L1
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Aptamer 1consisting of 52bases.cagcttccaaacgctgattttaagtccaaccgacaatcactacctcgggtgt>PD
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L1
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Aptamer 2consisting of 52bases.ccaacttgagggaatttatattacgaaataaaggattgcgggataccaaagg>PD
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L1
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Aptamer 3consisting of 52bases.gcgcgtagttggtgcacgaccgacttgccgatatattctggtcacggcggag>PD
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L1
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Aptamer 4consisting of 52bases.g...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄必胜，胡咏武，
申请(专利权)人：优葆优保健康科技宁波有限公司，
类型：发明
国别省市：