注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，将配置好的浓度为0.1μg/μl衣霉素(TM)溶液通过腹腔注射的给药方式注射到小鼠体内，12h后采用颈椎脱臼方法处死小鼠并收集血液、肝脏组织进行形态、病理及生化指标分析。该方法不仅操作简便、建模周期短、建模成功率高、生物利用率高，而且为建立急性肝损伤模型小鼠提供了新思路，同时为研究肝损伤及病情进展的发病机制提供实验工具，为临床肝病的预防、治疗提供理论基础。治疗提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法


[0001]本专利技术属于动物模型构建
，具体涉及一种腹腔注射诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法。

技术介绍

[0002]肝病是威胁健康的重大疾病之一，其患病率和致死率均很高。长期服用药物、患有炎症性肝病(如病毒性肝炎、脂肪型肝炎或酒精性肝炎)、生活饮食习惯不健康(长期的熬夜、酗酒、工作压力大)等原因都会造成一定程度的肝损伤，长期的肝损伤得不到有效治疗便会发展为肝硬化、肝癌甚至死亡。而小鼠作为常规的实验动物，因此建立急性肝损伤的小鼠模型在肝病致病机理研究及药物研发中非常重要。
[0003]目前常用的急性肝损伤小鼠模型有四氯化碳(CCl4)、α
‑
萘异硫氰酸酯(ANIT)、3，5
‑
二乙氧基羰基
‑
1，4
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二氢
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2，4，6
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三甲基吡啶 (DDC)、脂多糖(LPS)/D
‑
氨基半乳糖(D
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GaLN)、对乙酰氨基酚(APAP) 等诱发的肝损伤模型。不同急性肝损伤动物模型有不同的生化及肝脏病理特点，每一种动物模型都有其优势与不足，尚没有完全理想的急性肝损伤动物模型。另外，现有技术中公开了一种新型的内质网应激型肝损伤小鼠造模方法，例如公开号CN103735561A的专利公开了采用衣霉素二甲基亚砜溶液作为内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，所述方法虽然能在给药8～48h后诱导急性肝损伤的发生，但是该方法采用的是灌胃给药的方法，内质网应激诱导剂经胃肠道吸收，会存在胃肠道首过代谢从而导致生物利用率降低的现象。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种新型的腹腔注射衣霉素溶液从而诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，所述方法不仅操作简便、建模周期短、建模成功率高，而且小鼠生物利用率高。技术方案包括以下步骤：
[0005]1、衣霉素溶液的配制；
[0006]①
150mM葡萄糖溶液的配制：精密称取810.72mg葡萄糖溶于30ml 灭菌水中，震荡溶解。
[0007]②
0.1μg/μl衣霉素(TM)溶液的配制：精密称取1mg衣霉素粉末溶解于100μl二甲亚砜(DMSO)中，再加入10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存。
[0008]③
1％DMSO对照液的配制：取100μl二甲亚砜(DMSO)溶液加入到10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存。
[0009]④
将7周龄C57BL/6小鼠按体重大小随机分成对照组和实验组两组，每组12只，实验组开始腹腔注射步骤
②
中配制的TM溶液(100μl/10g)，与此同时对照组腹腔注射步骤
③
中配制的 1％DMSO对照液(100μl/10g)，12h后处死取材。
[0010]⑤
观察肝脏形态、病理图并检测肝损伤相关的生化指标。
[0011]有益效果
[0012]本专利技术是腹腔注射衣霉素溶液从而诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，由于采用的是腹腔注射的方法，该方法较好的避免了胃肠道首过代谢现象，从而达到用较低剂量的衣霉素(1μg/g)、且在短周期内(12h)即可完成急性肝损伤模型的建立，为建立急性肝损伤小鼠模型提供了新思路，同时为研究肝损伤及病情进展的发病机制提供实验工具，为临床肝病的预防、治疗提供理论基础。
具体实施方式
[0013]本专利技术是腹腔注射衣霉素溶液从而诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，具体实施方式包括：
[0014]①
溶液的配制：
[0015]150mM葡萄糖溶液的配制：用分析天平精密称取810.72mg葡萄糖粉末于50ml无菌EP管里，并向EP管加入30ml灭菌水，震荡溶解。
[0016]0.1μg/μl衣霉素(TM)溶液的配制：用分析天平精密称取1mg 衣霉素粉末溶解于100μl二甲亚砜(DMSO)中，再加入10ml的150mM 葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存。
[0017]1％DMSO对照液的配制：取100μl二甲亚砜(DMSO)溶液加入到 10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存。
[0018]②
小鼠的选择
[0019]从公司购买一批6周龄的C57BL/6小鼠，体重为18g
‑
20g，均为 SPF级，饲养于SPF级动物房一周，饲养环境为温度25℃、湿度为 50％
‑
55％、光照12h黑暗12h、可自由进食和饮水。一周后按体重随机分为两组，每组包括12只。
[0020]③
腹腔注射
[0021]吸取药品，并去除气泡。可以将针头向上，吸取一段气体后，在缓慢排除气体，以达到取出气泡的效果。用一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的头背部皮毛，腹腔向上。将事先吸取好液体的注射器针尖平面朝上，平行扎入皮内后，注射器与腹腔呈45度角刺入腹腔，感觉针尖部分可以移动后，注射样品。
[0022]④
对照组给药
[0023]对照组每一只小鼠称重并记录体重，按照体重来给药，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的浓度为1％DMSO对照液。给药12h后经摘除眼球收集血液后颈椎脱臼法处死小鼠，并收集小鼠肝脏。
[0024]⑤
实验组给药
[0025]实验组每一只小鼠称重并记录体重，按照体重来给药，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的浓度为0.1μg/μl的TM溶液。给药 12h后经摘除眼球收集血液后颈椎脱臼法处死小鼠，并收集小鼠肝脏。
[0026]⑥
肝脏分析
[0027]肝脏形态：将收集好的小鼠肝脏用预冷的PBS缓冲液清洗后，放于培养皿上拍照记录形态。
[0028]肝脏病理：首先取小鼠新鲜肝脏中间部位装入包埋盒中并泡在 4％PFA中过夜，过夜后采用乙醇梯度脱水法脱水，按下表程序脱水。
[0029][0030][0031]其次，将脱好水的组织取出，用石蜡包埋机包埋组织，再用石蜡切片机切厚度为4μm的组织。按下表步骤进行苏木素
‑
伊红(H&E)染色。
[0032][0033]最后，染完色后，用中性树胶封片，封片过程中要注意避免出现气泡，吹干即可在显微镜下观察并拍照。
[0034]血液生化指标检测：提前在灭菌的1.5ml EP中加入5μl的肝素钠，使用前用手指弹管底，让肝素钠均匀分散在管壁上。小鼠取材前用摘眼球法取血，避免出现凝血现象。取完血后冰上静置30min，在 4℃条件下3000rpm离心15min，吸取上清液即为血浆，按照血浆谷丙转氨酸(ALT)、谷草转氨酸(AST)试剂盒说明书的方法步骤进行 ALT、AST的检测。
[0035]本专利技术最终分析，从肝脏形态上看，实验组肝脏呈黄色，大而软，部分区域呈黄白相间的斑纹状；H&E染色病理显示实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，其特征在于，需要以下步骤：1)衣霉素溶液的配制；1
‑
1)150mM葡萄糖溶液的配制：精密称取810.72mg葡萄糖溶于30ml灭菌水中，震荡溶解；1
‑
2)0.1μg/μl衣霉素TM溶液的配制：精密称取1mg衣霉素粉末溶解于100μl二甲亚砜(DMSO)中，再加入10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存；1
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3)1％DMSO对照液的配制：取100μl二甲亚砜DMSO溶液加入到10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存；2)将7周龄C57BL/6小鼠按体重大小随机分成对照组和实验组两组，每组数量按需要分配，实验组开始腹腔注射步骤1
‑
2)中配制的TM溶液100μl/10g，与此同时对照组腹腔注射步骤1
‑
3)中配制的1％DMSO对照液100μl/10g，12h后处死取材；3)观察肝脏形态、病理图并检测肝损伤相关的生化指标。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中小鼠的体重为18g
‑
20g，均为SPF级，饲养于SPF级动物房一周，饲养环境为温度25℃、湿度为50％
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55％、光照12h黑暗12h、自由进食和饮水，一周后按体重随机分为对照组。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中腹腔注射时的步骤：吸取药品，并去除气泡；将针头向上，吸取一段气体后，在缓慢排除气体，以达到取出气泡的效果；用一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的头背部皮毛，腹腔向上；将事先吸取好液体的注射器针尖平面朝上，平行扎入皮内后，注射器与腹腔呈45度角刺入腹腔，感觉针尖部分移动，注射样品。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，对照组给药具体如下：每一只小鼠称重并记录体重，按照体重来...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兰香，黄昭，郭豪杰，程旺开，熊冉，张佳佳，
申请(专利权)人：芜湖职业技术学院，
类型：发明
国别省市：