一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程领域，该制备方法包括如下步骤：(1)获得重组载体：选取人类三型胶原保守区域肽段，将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8，将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体；(2)构建重组基因工程菌：提取质粒、将其转化到BL21

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质之一，胶原蛋白水解物具有显著生物活性，如抗氧化特性、抗高血压活性、降脂活性以及修复受损皮肤的性质。由于胶原蛋白在皮肤中具有双重作用：提供弹性蛋白和胶原蛋白形成的构建模块，充当配体或结合成纤维细胞受体刺激合成分泌透明质酸；因此广泛应用于护肤品之中。胶原蛋白是右旋三螺旋结构，由重复氨基酸三联体序列组成：甘氨酸
‑
X
‑
Y，其中X通常是脯氨酸，Y通常是羟脯氨酸。在多肽链的每第三个位置存在小氨基酸甘氨酸允许沿着胶原分子中心轴紧密堆积三螺旋。非螺旋状，球状区域存在于胶原蛋白分子的任何一端，在用适当的蛋白酶切割之前防止原纤维形成。导致其作为支架材料受欢迎的特性包括其相对低的毒性，基质金属蛋白酶的自然降解，易于交联和功能化以及物种之间存在的氨基酸序列的同源性。
[0003]动物提取胶原蛋白在生物材料领域普遍应用于药物输送和组织工程。从皮肤伤口愈合，到骨支架，到胶原蛋白水凝胶，由于它们的注射性质和原位自组装，也被用于了包括心肌、椎间椎间盘、真皮替代物和再生软骨，但在临床应用中还有许多问题存在。主要障碍是所用胶原的来源，来源于动物或人体的胶原蛋白主要缺点是可能传播疾病，过敏反应，病原体污染。此外，还存在批次之间的差异以及文化原因增加了对动物来源胶原的使用限制。因此，在制备人源胶原蛋白的
，亟需开发一种纯度高、安全性高、亲水性强、生物相容性好的人源胶原蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。
[0005]本专利技术的技术方案是：一种重组人源胶原蛋白，该重组人源胶原蛋白的编码基因RHIIIC8，RHIIIC8的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；RHIIIC8的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0006]一种含有编码基因RHIIIC8的表达载体。
[0007]一种含有编码基因RHIIIC8的基因工程菌。
[0008]一种重组人源胶原蛋白的制备方法，方法包括如下步骤：
[0009](1)获得重组载体：选取人类三型胶原保守区域肽段：
[0010]GERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPT，将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8，将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体；
[0011](2)构建重组基因工程菌：提取质粒、将其转化到BL21
‑
DE3
‑
PLySs感受态细胞中，挑取单克隆并对其扩大培养，获得重组基因工程菌；
[0012](3)制备重组人源胶原蛋白：经过诱导表达目的蛋白，然后对表达产物进行分离纯化，得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。
[0013]进一步的技术方案，步骤(3)中分离纯化的具体步骤如下：
[0014](3.1)将步骤(2)中的工程菌接种至LB培养基中，37℃培养过夜，按照体积比1:100转接LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6
‑
8小时，离心力为5000xg离心5分钟，收集菌体沉淀；
[0015](3.2)用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀，选择性加入终浓度1
‑
5mg/ml溶菌酶的Triton X
‑
100溶液帮助裂解细胞，在冰浴下超声破菌，12000rpm离心20min，收集上清液；所述溶菌酶的Triton X
‑
100溶液加入量以重悬所用PBS缓冲液体积为10ml/40ml；
[0016](3.3)用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，优选洗脱1柱体积，洗涤至柱上仅剩下了纯RHIIIC8蛋白，在柱上加入Prescission Protease蛋白酶，即PPase，于室温或冰上轻摇2小时，将RHIIIC8蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱，优选1/2柱体积，收集洗脱液，所得产物透析过夜，冻干，获得纯化的重组人源胶原蛋白；
[0017]其中，所述蛋白酶加入量以柱子体积计为1μL/5mL。
[0018]进一步的技术方案，步骤(3.1)中LB培养基液体的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.5，在LB培养基液体中添加15g/L琼脂混匀后得到LB培养基平板。
[0019]进一步的技术方案，步骤(3.2)中的超声破菌条件为：280W、2s超声，5s间歇，保护温度25℃，破菌时长为15min。
[0020]进一步的技术方案，步骤(3.3)中冻干的具体步骤为：每5mg蛋白依次加入体积浓度为10％，5％，3％，2％，1％的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在
‑
40℃预冻10min，最后
‑
35℃冻干。
[0021]一种用于组织工程、美容护肤的生物材料，生物材料包含权利要求1所述编码基因的重组人源胶原蛋白或权利要求4
‑
8任一所述制备方法制备得到的重组人源胶原蛋白。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]1、本专利技术所选择序列完全来自于人的III型胶原蛋白保守区域，并对序列进行了不影响氨基酸序列前提下的密码子优化；采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，20小时即可完成一轮发酵，将其应用于生产具有成本低、周期短的优点，BL21
‑
DE3
‑
PLySs表达菌种能够降低细菌的内源蛋白表达并进一步提高了目的蛋白的纯度和产量，表达蛋白量可占菌体总蛋白的25％左右，可达到每毫菌液沉淀含有0.25毫克目的蛋白；
[0024]2、通过序列分析和实验筛选，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，具有非常好的亲水性和稳定性，可以在人体中行使天然蛋白的功能；
[0025]3、本专利技术产品经过活性检测，本专利技术方法制备的重组人源胶原蛋白室温保存30天活性没有明显下降，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
附图说明
[0026]图1为本专利技术中pET22b
‑
RHIIIC8载体构建的质粒图谱，
[0027]图2为本专利技术三型胶原肽段筛选结果，
[0028]图3为本专利技术RHIIIC8与人源胶原蛋白氨基酸比对结果，
[0029]图4为本专利技术RHIIIC8蛋白纯化后的电泳图，
[0030]图5为本专利技术RHIIIC8蛋白与人源胶原蛋白相对照的生物活性检测结果。
具体实施方式
[0031]下面通过非限制性实施例，进一步阐述本专利技术，理解本专利技术。
[0032本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，该重组人源胶原蛋白的编码基因RHIIIC8，RHIIIC8的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；RHIIIC8的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。2.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。3.含有权利要求1所述编码基因的基因工程菌。4.一种如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获得重组载体：选取人类三型胶原保守区域肽段，将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8，将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体；(2)构建重组基因工程菌：提取质粒、将其转化到BL21
‑
DE3
‑
PLySs感受态细胞中，挑取单克隆并对其扩大培养，获得重组基因工程菌；(3)制备重组人源胶原蛋白：经过诱导表达目的蛋白，然后对表达产物进行分离纯化，得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。5.根据权利要求2所述的一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中分离纯化的具体步骤如下：(3.1)将步骤(2)中的工程菌接种至LB培养基中，37℃培养过夜，按照体积比1:100转接LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6
‑
8小时，离心力为5000xg离心5分钟，收集菌体沉淀；(3.2)用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀，选择性加入终浓度1
‑
5mg/ml溶菌酶的Triton X
‑
100溶液帮助裂解细胞，在冰浴下超声破菌，12000rpm离心20min，收集上清液；所述溶菌酶的Triton X
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟，
申请(专利权)人：江苏亨瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：