重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。所述检查方法采用pH7.0无菌氯化钠

【技术实现步骤摘要】
重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法


[0001]本专利技术属于非无菌产品微生物限度检查
，涉及一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。

技术介绍

[0002]微生物限度检查中使用的稀释剂对于微生物的检出率、微生物的生长及适用性均有影响，主要包括0.9％无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液，pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水。
[0003]0.9％无菌氯化钠溶液作为稀释剂的特点是其渗透压和人体血液相当，待在此稀释剂中的微生物就相当于待在血液中，不会因为渗透压而吸水破裂。
[0004]pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液，其最主要特点是“缓冲”，也就是在缓冲作用下pH变化不会非常大，起调节渗透压的作用，适合于对pH值敏感的微生物，此外蛋白胨会给微生物提供氮源、氨基酸和碳源等营养物质。
[0005]pH7.2磷酸盐缓冲溶液，由磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的混合溶液组成，其中磷酸一氢盐是呈碱性的，而磷酸二氢盐是酸性的，当微生物分泌酸性物质时会与磷酸一氢盐反应成磷酸二氢盐，当分泌碱性物质时则与磷酸二氢盐成磷酸一氢盐，这样就使整个体系维持在一个pH较稳定的范围。由于磷酸缓冲液接近中性，恰在生理性pH范围，且成本较低，成为生命科学领域应用最广、最普及的无机盐缓冲液，也是免疫学、细胞生物学和分子生物学实验室必备的常用缓冲液之一。
[0006]重组人源化胶原蛋白为水溶性产品，能够促进成纤维细胞生长，溶水后可渗透至真皮，基因序列与人源胶原100％相同，具有抗敏性，促进细胞生长形成保护屏障，属于化妆品级，需按《化妆品安全技术规范》做微生物限度相关的检查。文献1采用0.9％无菌氯化钠溶液作为稀释剂，建立了重组人胶原蛋白微生物限度检查方法(李晓颖,侯增淼,史瑾,等.重组人胶原蛋白微生物限度检查方法的建设及验证[J].科技创新与应用,2017(35):98
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99.)。然而上述文献中针对的重组人胶原蛋白为其公司生产的，对于不同的重组人源化胶原蛋白而言，由于发酵菌和发酵条件完全不同，蛋白存在差异，因此稀释剂不具有普适性。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。
[0008]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0009]重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法，包括以下步骤：
[0010](1)以pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液为稀释剂，对待检测的重组人源化胶原蛋白进行稀释，充分振荡混匀，静置，取其上清液作为菌检液，所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生；
[0011](2)将菌检液注入到灭菌平皿内，然后将融化并冷却至45℃～50℃的胰酪大豆胨
琼脂培养基倾注到灭菌平皿内，随即转动平皿，使菌检液与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置于36℃
±
1℃培养箱内培养3～5天；另取不加菌检液的空灭菌平皿，加入与菌检液等体积的稀释剂，并加入胰酪大豆胨琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃
±
1℃培养箱内培养3～5天，作为阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果有菌生长应进行偏差调查。
[0012]本专利技术步骤(1)中，稀释倍数根据待检测的重组人源化胶原蛋白的含菌量进行调节，含菌量越高，稀释倍数越大。稀释倍数可以为1:10～1:10000。
[0013]本专利技术步骤(2)中，胰酪大豆胨琼脂培养基为本领域常规使用的胰酪大豆胨琼脂培养基，按胰酪大豆胨琼脂与水的比例为4g：100mL进行配制。
[0014]本专利技术步骤(2)中，菌检液与胰酪大豆胨琼脂培养基的体积比为1:15。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0016]本专利技术通过使用不同稀释剂对重组人源化胶原蛋白进行微生物限度检查，比较不同的稀释剂对重组人源化胶原蛋白中微生物的检出率、微生物的生长及适用性，确定了针对本申请的重组人源化胶原蛋白而言，pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液均适宜作为稀释剂，提高重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查准确度。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详述。
[0018]实施例1
[0019]1、稀释剂和培养基的配制：
[0020]0.9％氯化钠溶液：氯化钠0.9g加蒸馏水至1000mL，溶解后分装，121℃高压灭菌20min。
[0021]pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液：取磷酸氢二钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g加纯化水1000mL溶解，灭菌。
[0022]pH7.2磷酸盐缓冲溶液：取pH7.2磷酸盐缓冲溶液粉末41g蒸馏水加至1000mL，121℃高压灭菌15min。
[0023]灭菌蒸馏水：蒸馏水分装，121℃高压灭菌20min。
[0024]胰酪大豆胨琼脂培养基：取胰酪大豆胨琼脂12g溶于300mL水中，置121℃高压灭菌20min。
[0025]2、供试品的控制菌检查中所使用的培养基的适应性检查
[0026](1)菌种，采用的菌株及培养基如表1所示，试验用菌株的传代次数不得超过5代。
[0027]表1
[0028]试验菌株菌株用培养基特性对照培养基金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基促生长能力甘露醇氯化钠琼脂培养基
[0029](2)适应性检查：分别用0.9％氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水作菌悬液，制成1mL不少于100cfu的金黄色葡萄球菌液，各取1mL接种于两个平板上，倾入胰酪大豆胨琼脂培养基，同时作阴性对照。另取两个平板各取1mL不少于100cfu的金黄色葡萄球菌液于两个平板上，倾入甘露醇氯化钠琼脂培养基，同时作阴性对照。同置30～35℃培养18～24小时，阴性对照试验应无菌生长，如果有菌生长应进
行偏差调查。
[0030](3)结果判断：24小时后检查被检培养基上的菌落数，不小于对照培养基上菌落平均数的70％，菌落形态大小与对照培养基上菌落一致，由此判断，培养基的适用性符合规定。
[0031]3、供试品的需氧菌检测
[0032](1)称取重组人源化胶原蛋白(由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生)1.0g，分别加到装有玻璃珠及0.9％氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。用其上清液作为1:10的菌检液，用灭菌吸管吸取1：10稀释2mL的菌检液，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pH7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液为稀释剂，对待检测的重组人源化胶原蛋白进行稀释，充分振荡混匀，静置，取其上清液作为菌检液，所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生；(2)将菌检液注入到灭菌平皿内，然后将融化并冷却至45℃～50℃的胰酪大豆胨琼脂培养基倾注到灭菌平皿内，随即转动平皿，使菌检液与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置于36℃
±
1℃培养箱内培养3～5天；另取不加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉莉，赵霜，邵秀萍，钱文娟，
申请(专利权)人：浙江诸暨聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：