一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，包括以下步骤：S1：配制含第一诱导剂和第二诱导剂的TB培养基；所述第一诱导剂为卵磷脂；所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:(0.1

【技术实现步骤摘要】
一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，尤其涉及一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的功能性结构蛋白，广泛存在于机体内的皮肤、肌腱、血管、牙齿、骨骼等结缔组织的细胞外基质中，在伤口愈合、细胞修复、皮肤抗衰老、细胞免疫等方面具有重要的应用价值。胶原蛋白由3条α链的多肽链亚基组成，α链自身构型为左手螺旋，三条α链又互相缠绕成右手螺旋结构，即胶原蛋白的“胶原域”，其肽链通式为(Gly
‑
X
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Y)n，其中X一般为Pro（脯氨酸），Y一般为Hyp（羟脯氨酸）。目前，胶原蛋白主要分为I型、II型、III型等类型，I型胶原蛋白分子组成为[α1(I)]2α2(I)，主要分布于骨骼中；II型胶原蛋白由[α1(II)]3组成，主要由软骨细胞产生；III型胶原蛋白分子组成为[α1(III)]3，由于半胱氨酸的存在，肽链间能形成二硫键，可构成细纤维，主要存在于表皮层和真皮层之间的微胶原层，是维持肌肤高弹饱满的关键。
[0003]重组人源胶原蛋白是基于人体皮肤Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的原始基因序列，并一步优化选择其中高水溶性、高生物活性的部分，进行密码子优化和拼接重组，得到了全新的重组人源Ⅲ型胶原蛋白序列，并导入大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母等微生物体内，利用微生物发酵技术进行规模化生产。但是，目前利用微生物发酵重组人源胶原蛋白一般需要利用IPTG诱导，作为乳糖类似物，应用于Lac乳糖操纵子的表达系统，但IPTG对于人体存在潜在的不可逆毒性，摄入或皮肤吸收后，造成细胞损伤，又由于IPTG稳定性高不被菌体代谢，利用其诱导时，能在人体内不断富集，存在生物安全性问题。此外，利用IPTG诱导的浓度不易控制，由于IPTG竞争性地与阻遏蛋白结合以启动目的蛋白的转录，浓度较低时，无法诱导目的蛋白完全表达，产量低；浓度较高时，会导致包涵体的形成。因此，如何提供一种非IPTG诱导的高表达水平的重组人源化胶原蛋白发酵方法是亟待解决的技术难题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，以解决传统发酵工艺需要采用IPTG诱导表达的技术问题。
[0005]基于上述目的，本专利技术提供了一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，包括以下步骤：S1：配制TB培养基：胰蛋白胨20
‑
30g/L、酵母提取物40
‑
60g/L、K2HPO470
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75mM、KH2PO415
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20mM、第一诱导剂0.8
‑
1.2mM、第二诱导剂0.05
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0.1g/L、蛋白保护剂0.5
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1g/L、甘油3
‑
5g/L、余量为水；所述第一诱导剂为卵磷脂；在重组人源化胶原蛋白的发酵生产中，卵磷脂可作为其表达的外源诱导剂，卵磷脂能够在大肠杆菌细胞膜上形成微区域，提高细胞膜的流动性以及扩散作用，同时，卵磷脂
能结合目标蛋白的信号肽，促进胶原蛋白转运到膜外，进而提高重组人源化胶原蛋白的表达和分泌，提高其收获量；所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:(0.1
‑
0.3)的质量比混合而成；S2：一级种子培养：将大肠杆菌生产种子接种至LB培养基，于温度为36
‑
38℃、摇床转速为180
‑
220r/min的条件下，震荡过夜培养；S3：发酵培养：将S2所得一级种子接种至含有TB培养基的发酵罐内，36
‑
38℃发酵培养12
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18h；S4：诱导表达：当发酵罐内发酵体系的光密度OD值达到3
‑
5时，调整诱导温度设置为15
‑
20℃，低温诱导20
‑
28h。
[0006]优选的是，所述大肠杆菌生产种子占LB培养基的质量百分比为0.2
‑
0.3%。
[0007]优选的是，所述LB培养基配方及比例为：胰蛋白胨10
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15g/L、酵母提取物25
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35g/L、葡萄糖6
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10g/L、余量为水。
[0008]优选的是，所述大肠杆菌生产种子为大肠杆菌E.coilBL21(DE3)。
[0009]优选的是，所述一级种子占TB培养基的质量百分比为1.8
‑
2.2%。
[0010]优选的是，所述发酵罐的参数设置如下：pH=6.8
‑
7.2，溶解氧DO值为37
‑
43%，搅拌速度为450
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550r/min，通气量为2.8
‑
3.2L/min。
[0011]优选的是，所述蛋白保护剂为甘露醇；甘露醇作为目标蛋白保护剂，提高重组人源化胶原蛋白产物的稳定性，保护其免受水解酶的降解作用。
[0012]优选的是，S1中，配制TB培养基：胰蛋白胨25g/L、酵母提取物50g/L、K2HPO472mM、KH2PO417mM、第一诱导剂1mM、第二诱导剂0.08g/L、蛋白保护剂0.8g/L、甘油4g/L、余量为水；所述第一诱导剂为卵磷脂；所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:0.2的质量比混合而成。
[0013]本专利技术的有益效果：本专利技术首次以卵磷脂为第一诱导剂，以泛酸、延胡索酸组配第二诱导剂，二者协同提高重组人源化胶原蛋白表达水平及产量，专利技术人意外地发现，在含0.8
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1.2mM卵磷脂的TB培养基中，引入泛酸、延胡索酸，相比于不含泛酸、延胡索酸的发酵体系，重组人源化胶原蛋白收率至少提高了178.9%，证明了第二诱导剂与卵磷脂能协同诱导重组人源化胶原蛋白的选择性表达。究其原因，一方面，泛酸和延胡索酸作为抗氧化剂，清除发酵体系的自由基含量，防止卵磷脂氧化变质，提高卵磷脂的稳定性；另一方面，可能的原因是，泛酸参与大肠杆菌细胞膜中磷脂双分子层界面的生物合成，进而有助于提高细胞膜表面对卵磷脂的识别位点数量、亲和性及有效利用率，以改善细胞膜的流动性以及对胶原蛋白的转运作用。
[0014]此外，泛酸可作为碳源，在大肠杆菌的代谢作用下，形成乙酰辅酶A，促进大肠杆菌分裂繁殖，有效提高发酵体系的菌体数量，同时，在泛酸和乙酰辅酶A的作用下，大肠杆菌加快启动表达编码胶原蛋白的基因，促进mRNA的翻译，从而双重提高重组人源化胶原蛋白的合成速率。
[0015]延胡索酸是三羧酸循环的中间产物，可促进大肠杆菌的生长和代谢，进而提高重组人源化胶原蛋白的表达和合成。
[0016]本专利技术发酵工艺无需采用IPTG诱导表达，发酵体系易于控制，发酵产率高，周期
短，发酵及诱导总时间仅在46h以内，安全无害。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1：配制TB培养基：胰蛋白胨20
‑
30g/L、酵母提取物40
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60g/L、K2HPO470
‑
75mM、KH2PO415
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20mM、第一诱导剂0.8
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1.2mM、第二诱导剂0.05
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0.1g/L、蛋白保护剂0.5
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1g/L、甘油3
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5g/L、余量为水；所述第一诱导剂为卵磷脂；所述第二诱导剂由泛酸、延胡索酸按1:(0.1
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0.3)的质量比混合而成；S2：一级种子培养：将大肠杆菌生产种子接种至LB培养基，于温度为36
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38℃、摇床转速为180
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220r/min的条件下，震荡过夜培养；S3：发酵培养：将S2所得一级种子接种至含有TB培养基的发酵罐内，36
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38℃发酵培养12
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18h；S4：诱导表达：当发酵罐内发酵体系的光密度OD值达到3
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5时，调整诱导温度设置为15
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20℃，低温诱导20
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28h。2.根据权利要求1所述的一种提高重组人源化胶原蛋白表达水平的发酵工艺，其特征在于，所述大肠杆菌生产种子占LB培养基的质量百分比为0.2
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0.3%。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进，李书文，张涛，路宝，钱强，
申请(专利权)人：江苏亨瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：