一种高纯度胶原蛋白提取工艺制造技术

技术编号:30560935 阅读:13 留言:0更新日期:2021-10-30 13:43
本发明专利技术提供了一种高纯度胶原蛋白的提取工艺,属于蛋白质提取技术领域。所述的提取工艺包括跟腱预处理步骤和胶原蛋白提取纯化步骤,在实施过程中通过合理控制预处理过程中的试剂,以及各种试剂的浓度,混合方式以及加入顺序,明显提高了预处理过程中跟腱脂肪的去除效率,提高了胶原蛋白的纯度和活性,并且得到的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构,安全性更好,可满足化妆品,医疗器械、组织工程等需求。组织工程等需求。组织工程等需求。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度胶原蛋白提取工艺


[0001]本专利技术属于蛋白质提取
,具体涉及一种从跟腱中提取高纯度胶原蛋白的工艺。

技术介绍

[0002]胶原蛋白(collagen)是动物体内含量最为丰富的一类蛋白质,约占全部蛋白质含量的30%以上,广泛分布于骨骼、软骨、筋腱、皮肤、血管等组织和器官中。在已知的28种胶原类型中,I型胶原含量最为丰富、分布最为广泛。因其具有良好的生物相容性、低免疫原性、良好的生物力学性能等,可作为天然的生物框架组分,在临床医学、组织工程、医学生物工程等领域具有巨大的应用空间。
[0003]现有的胶原蛋白的提取方法很多,但几乎都存在一个杂质的去除问题,通过加入丙酮等有机溶剂去除脂类物质都会有不同程度的残留,并且这些有机溶剂很多都有毒性。提高胶原的提取纯度,除选择适合的组织作为原材料外,恰当的预处理方法也是极其重要的。原材料中的脂肪组织必须充分去除,胶原中一旦有脂质混入,无论是进行中性还是酸性沉淀溶解,都是不能去除的,最后只能得到乳浊状的胶原溶液。化妆品级胶原溶液对微生物的含量都有一定的要求,更高端的一些医用胶原溶液最终都需要以无菌提供。无论是冻干品还是液体状态保存,都需要在跟腱预处理阶段以合适的方法减少微生物的含量,让后期的除菌工艺更容易。
[0004]如中国专利申请201110361186.X中公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法,以新鲜猪皮为原料,经预处理,去除脂肪,经酸酶解法处理后,使用超声波处理,进一步提高提取效率,最后纯化制得高纯度的胶原产品,在通过酶法交联和冷冻干燥制得胶原蛋白海绵,该申请的猪皮预处理过程中使用丙酮或无水乙醚作为有机溶剂用于去除脂类,容易产生毒性残留。
[0005]中国专利申请201811465406.1中公开了一种胶原蛋白提取方法,包括:

牛跟腱解冻,去血水、表面异物和筋膜,用溶液进行一次预处理;

步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜,用溶液进行二次预处理;

步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片,用溶液进行前处理;

将前处理完的牛跟腱切片持续酶解,离心取上清制备胶原粗提液;

调节胶原粗提液pH,加入中性盐盐析,离心获得胶原蛋白沉淀;

加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀,获得特定浓度的胶原蛋白,该申请中预处理步骤进行了两次,目的是将脂肪组织等全部去除,其中在预处理中使用的试剂为乙醇溶液、次氯酸钠、EDTA

Na2、TritionX

114、磷酸三丁酯、Triton X

100、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液,该申请仅关注了胶原蛋白的纯度,但是并没有对胶原蛋白的三螺旋结构完整性进行研究,并且未进行病毒工艺验证,提取的胶原蛋白无法应用于组织工程领域。
[0006]因此,需要开发一种三螺旋结构完整,纯度更高,安全性更好,可满足化妆品,医疗器械、组织工程等需求的胶原蛋白的提取方法。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的不足,本专利技术旨在提供了一种高纯度胶原蛋白提取工艺,本专利技术采用独特的跟腱预处理工艺,能够明显降低跟腱碎片中微生物的含量,达到病毒灭活效果,处理后的跟腱碎片提取的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构,纯度更高,安全性更好,可满足化妆品,医疗器械、组织工程等需求。
[0008]为达到本专利技术的技术效果,本专利技术是通过以下技术方案来实现:
[0009]一种高纯度胶原蛋白提取工艺,包括以下步骤:
[0010](1)跟腱预处理步骤;
[0011](2)胶原蛋白提取纯化步骤;
[0012]所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤:
[0013]①
将跟腱解冻,去除血水和表面筋膜,纯化水清洗后,用酒精浸泡,然后用纯化水冲洗三遍,放入冰箱中,冷冻备用;
[0014]②
待跟腱完全冻硬后取出,将跟腱表面残余的脂肪膜去掉,然后进行切片处理,得到跟腱切片;
[0015]③
取跟腱切片进行以下处理:
[0016]第一步:采用过氧乙酸浸泡,然后用纯化水清洗三次;
[0017]第二步:重复第一步处理一次;
[0018]第三步:用磷酸三丁酯和吐温80混合溶液浸泡,用纯化水清洗三次;
[0019]第四步:用氢氧化钠和TritonX

114混合溶液浸泡,纯化水清洗三次;
[0020]第五步:用氯化钠和碳酸钠混合溶液浸泡,用纯化水清洗三遍后,将跟腱碎片冻干后研磨成粉末,得到跟腱粉末,备用。
[0021]上述步骤

中所述的酒精的体积分数为70

75%,优选为75%,浸泡时间为3

10分钟,优选为6

8分钟;
[0022]上述第一步中所述的过氧乙酸的浓度为0.2%

0.5%,优选为0.3%

0.4%;浸泡时间为2

5分钟;优选为3

4分钟。
[0023]上述第三步中所述的磷酸三丁酯的浓度为0.2%

0.5%;优选为0.3%

0.4%;所述的吐温80的浓度为0.1%

0.5%,优选为0.2

0.4%;浸泡时间为3

6分钟,优选为4

5分钟;
[0024]在一些优选实施例中,所述的磷酸三丁酯和吐温80混合溶液的浓度比例为1

2:1;优选为2:1。
[0025]上述第四步中所述的氢氧化钠的浓度为0.1%

0.3%;优选为0.2%

0.3%;所述的TritonX

114的浓度为0.1%

0.5%,优选为0.2%

0.4%;浸泡时间为2

6分钟,优选为3

5分钟。
[0026]在一些优选实施例中,所述的氢氧化钠和TritonX

114混合溶液的浓度比为1

3:1;优选为1

2:1;再优选为1.5:1。
[0027]上述第五步中所述的氯化钠的浓度为0.9%,所述的碳酸钠的浓度为0.1%

0.5%,优选为0.2%

0.4%;浸泡时间为1.5

2.5小时,优选为2小时。
[0028]在一些优选实施方案中,所述的氯化钠和碳酸钠混合溶液的浓度比为1:0.2

0.5,优选为3:1。
[0029]上述第五步中所述的冻干是采用液氮进行冻干,研磨得到的粉末的粒径为0.1毫米。
[0030]作为一个优选的技术方案,所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤:
[0031]①
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:包括以下步骤:(1)跟腱预处理步骤;所述的跟腱预处理步骤还包括以下分步骤:

将跟腱解冻,去除血水和表面筋膜,纯化水清洗后,用酒精浸泡,然后用纯化水冲洗三遍,放入冰箱中,冷冻备用;

待跟腱完全冻硬后取出,将跟腱表面残余的脂肪膜去掉,然后进行切片处理,得到跟腱切片;

取跟腱切片进行以下处理:第一步:采用过氧乙酸浸泡,然后用纯化水清洗三次;第二步:重复第一步处理一次;第三步:用磷酸三丁酯和吐温80混合溶液浸泡,用纯化水清洗三次;第四步:用氢氧化钠和TritonX

114混合溶液浸泡,纯化水清洗三次;第五步:用氯化钠和碳酸钠混合溶液浸泡,用纯化水清洗三遍后,将跟腱碎片冻干后研磨成粉末,得到跟腱粉末,备用;(2)胶原蛋白提取纯化步骤。2.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:第一步中所述的过氧乙酸的浓度为0.2%

0.5%;浸泡时间为2

5分钟。3.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:第三步中所述的磷酸三丁酯的浓度为0.2%

0.5%;所述的吐温80的浓度为0.1%

0.5%;浸泡时间为3

6分钟。4.根据权利要求3所述的高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:所述的磷酸三丁酯和吐温80混合溶液的浓度比例为1

2:1。5.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:第四步中所述的氢氧化钠的浓度为0.1%

0.3%;所述的TritonX

114的浓度为0.1%

0.5%;浸泡时间为2

6分钟。6.根据权利要求5所述的高纯度胶原蛋白提取工艺,其特征在于:所述的氢氧化钠和TritonX

114混合溶液的浓度比为1

3:1。7.根据权利要求1所述的高纯度胶...

【专利技术属性】
技术研发人员:夏伟张智武唐冬慧
申请(专利权)人:浙江崇山生物制品有限公司
类型:发明
国别省市:

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