聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质工程领域，特别是涉及聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法，所述聚合物阴离子填料选自NanoQ

【技术实现步骤摘要】
聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程领域，特别是涉及聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法。

技术介绍

[0002]利拉鲁肽[Arg34Lys26
‑
(N
‑
ε
‑
(γ
‑
Glu(N
‑
α
‑
十六酰基)))
‑
GLP
‑
1(7
‑
37)]为一种GLP
‑
1(胰高血糖素样肽
‑
1)类似物，英文名Liraglutide，其序列为H
‑
His
‑
Ala
‑
Glu
‑
Gly
‑
Thr
‑
Phe
‑
Thr
‑
Ser
‑
Asp
‑
Val
‑
Ser
‑
Ser
‑
Tyr
‑
Leu
‑
Glu
‑
Gly
‑
Gln
‑
Ala
‑
Ala
‑
Lys(Pal
‑
g
‑
Glu)
‑
Glu
‑
Phe
‑
Ile
‑
Ala
‑/>Trp
‑
Leu
‑
Val
‑
Arg
‑
Gly
‑
Arg
‑
Gly
‑
OH。利拉鲁肽由谷氨酸连接子将31个氨基酸主链Arg34
‑
GLP
‑
1(7
‑
37)和十六碳棕榈酸脂肪酸连接而成，连接位点位于26位Lys侧链氨基，结构详见附图1。利拉鲁肽由诺和诺德公司开发，并于2010年1月获得FDA批准上市，于2011年10月获CFDA批准在中国上市用于治疗Ⅱ型糖尿病。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP
‑
1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害起保护作用。2014年12月获FDA批准，用于BMI大于等于27(超重)同时伴有至少一种与超重相关疾病(高血压，2型糖尿病，高血脂等)，或BMI大于等于30(肥胖)的成年人减轻体重。
[0003]目前利拉鲁肽的制备可以分为化学合成和生物半合成。化学合成主要是通过固相合成氨基酸链，如专利CN107960079A、CN104045706B、CN103304660A、CN106699871A等公开的合成方法。但是化学合成普遍存在环境不友好、收率较低、反应步骤复杂、总体成本较高等问题。
[0004]生物半合成利拉鲁肽系通过生物手段制备中间体Arg34
‑
GLP
‑
1(7
‑
37)，通过化学修饰反应在中间体26位Lys侧链氨基上连接修饰剂，再通过层析等纯化手段获得利拉鲁肽。生物半合成法较化学合成法有成本低、环境污染小、收率高、反应条件温和等优点。但是，因为中间体上存在其他的修饰位点，导致中间体修饰工艺控制难度高、下游纯化工序复杂、整体的生产过程回收率较低。如专利CN104592381A、CN1951965A通过中间体(Arg34
‑
GLP
‑
1(7
‑
37))修饰获得利拉鲁肽，其工艺路线均包括中间体的化学修饰和修饰后的层析纯化，修饰反应均在反应釜中进行，反应结束后转移至层析设备上进行利拉鲁肽纯化，存在设备设施成本高、工艺繁琐、利拉鲁肽生产回收率低的问题。制备的利拉鲁肽均为液体或不定型粉末，其稳定性差，不利于运输和储存。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途。
[0007]优选地，所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ
‑
15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
[0008]优选地，所述用途为在利拉鲁肽中间体与利拉鲁肽修饰剂反应制备利拉鲁肽中的用途。
[0009]本申请还提供一种利拉鲁肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0010]1)在层析柱上装填聚合物阴离子交换填料，并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱；
[0011]2)将利拉鲁肽中间体溶液加入层析柱；
[0012]3)将利拉鲁肽修饰剂加入层析柱进行柱上修饰反应；
[0013]4)修饰反应完成后洗脱收集利拉鲁肽。
[0014]优选地，所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ
‑
15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
[0015]优选地，以修饰缓冲液Ⅰ的总体积为基准，所述修饰缓冲液Ⅰ包括10
‑
50mM碳酸钠、0.1～1.0mM EDTA、50～70％(v/v)乙腈的水溶液。
[0016]优选地，所述利拉鲁肽中间体为Arg34
‑
GLP
‑
1(7
‑
37)，结构如图2所示。
[0017]优选地，所述制备方法还包括将步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽进行结晶。
[0018]优选地，结晶的方法包括以下步骤：向步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽中加入结晶试剂结晶，从而获得利拉鲁肽晶体。
[0019]优选地，所述结晶试剂包括碱性氨基酸、酚类化合物和聚乙二醇。
[0020]优选地，以结晶体系的总体积为基准，所述碱性氨基酸的终浓度为0.1～1.0M，所述酚类化合物的终浓度为3～8g/L，所述聚乙二醇的终浓度为0.1
‑
0.5g/L。
[0021]优选地，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或多种。所述酚类化合物为苯酚。所述聚乙二醇的分子量为1000以上；更优选地，所述聚乙二醇为PEG5000。
[0022]如上所述，本专利技术的聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法，具有以下有益效果：
[0023](1)相较传统工艺，本专利技术实现了修饰反应和层析纯化在柱上同时进行，减少反应釜及管道设施的使用，因此可以节约设备设施，和传统工艺相比，降低有机试剂的使用量，减少危废的排放，明显提升了利拉鲁肽的生产回收率，降低了生产成本。
[0024](2)本专利技术将利拉鲁肽制备为形状规则的蛋白结晶，相较于等电点沉淀工艺制备的不定型粉末，结晶的利拉鲁肽在稳定性上具有优势。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述聚合物阴离子填料选自NanoQ
‑
15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为聚合物阴离子交换填料在利拉鲁肽中间体与利拉鲁肽修饰剂反应制备利拉鲁肽中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述利拉鲁肽中间体为Arg34
‑
GLP
‑
1(7
‑
37)，和/或，所述利拉鲁肽修饰剂为利拉鲁肽脂肪酸侧链。5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述利拉鲁肽修饰剂为棕榈酸
‑
谷氨酸
‑
OSU。6.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1)在层析柱上装填聚合物阴离子交换填料，并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱；2)将利拉鲁肽中间体溶液加入层析柱；3)将利拉鲁肽修饰剂加入层析柱进行柱上修饰反应；4)修饰反应完成后洗脱收集利拉鲁肽。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物阴离子填料选自NanoQ
‑
15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，以修饰缓冲液Ⅰ的总体积为基准，所述修饰缓冲液Ⅰ包括10
‑
50mM碳酸钠、0.1～1.0mM EDTA和体积分数为50～70％的乙腈的水溶液。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，彭小波，林巧，侯世兴，蔡俊杰，
申请(专利权)人：重庆宸安生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：