一种肝素结合蛋白测定试剂盒、制备方法及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物；所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物，所述包被抗体标记于所述固相支撑物上；所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物，所述标记抗体标记于所述示踪物上；所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种，以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体；所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对同一表位的抗体；所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂，所述底物为所述示踪物所对应的底物。该试剂盒通过与化学发光免疫分析仪结合，进行对样本中肝素结合蛋白含量的检测，该试剂盒检验灵敏度高、重现性好、准确度高，并且具有较宽的检测线性范围。并且具有较宽的检测线性范围。并且具有较宽的检测线性范围。

【技术实现步骤摘要】
一种肝素结合蛋白测定试剂盒、制备方法及使用方法


[0001]本专利技术属于体外诊断试剂领域，特别是涉及一种肝素结合蛋白测定试剂盒、制备方法及使用方法。

技术介绍

[0002]肝素结合蛋白(heparin
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binding protein，HBP)也被称为azurocidin或者CAP37，是中性粒细胞来源的颗粒蛋白。HBP是一种多功能、有活性的同源丝氨酸蛋白酶，相对分子质量为37kDa。HBP的结构为包含222个氨基酸的单链蛋白，含有8个半胱氨酸残基，在第100、114或145位天冬氨酸残基上具有糖基化位点，结构类似于中性粒细胞弹性蛋白酶，与其同源性为45％，与其他颗粒衍生丝氨酸蛋白酶的同源性为30％～37％。大约74％的HBP储存在嗜苯胺蓝颗粒中，18％在分泌小泡中，而8％在胞质膜上。
[0003]研究表明，HBP可以作为感染性疾病，尤其是严重的细菌感染的一种早期诊断标志。与其他传统炎症指标相比，它除了具有灵敏性高、特异性强、阳性/阴性检出率高等优点，还具有出现早，只在急性细菌感染时浓度极度升高，在病毒感染和非特异性炎症时却保持较低的水平等特点。更有意义的是，通过对HBP浓度的动态监测，可以对严重感染患者将要出现的休克以及循环衰竭进行预测，从而实现早期干预。
[0004]炎症就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。炎症是损伤和抗损伤的统一过程。凡能够引起组织和细胞损伤的因素都可成为炎症的原因。例如妇科炎症，据世界卫生组织对中国妇女的调查：41％的育龄女性患有不同程度的妇科炎症，而已婚女性妇科炎症的发病率更高达70％。
[0005]感染从发病率上讲，85
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90％为病毒；细菌大概不足10％。病毒性感染可由多种病毒引起，如呼吸道病毒、胃肠道病毒、皮肤和黏膜病毒等等，均为常见病。
[0006]脓毒症是指宿主对感染反应失调引起的致命性的器官功能障碍，脓毒症进一步发展，出现循环和细胞/代谢失调的脓毒症则被称为脓毒症休克。脓毒症起病急病程快的特点，因此抗生素治疗在脓毒血症早期诊断和治疗具有十分关键的重要，相关研究发现，脓毒症早期患者每延迟一小时治疗，患者存活率下降7.6％，在发生疾病1小时内得到正确诊治，患者存活率将达到70
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80％以上；6小时之后诊治，患者的生存率下降到30％以下。HBP具有杀菌、致炎、抗凋亡和提高细胞穿透力等生物学作用，其主要储存于中性粒细胞的噬天青颗粒中，是构成人类中性粒细胞的先天防御系统的一部分。健康人血中HBP水平很低，一般不超过10μg/L，当有感染发生时，部分细菌侵入到血管内，菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中性粒细胞释放HBP从而导致血中HBP含量升高。HBP在一般感染时能达到20～30ng/mL，ICU中严重感染可能超过100ng/mL甚至高达1000ng/mL以上；当HBP含量超过1000ng/mL时病人已经处于极度危险中，面临着随时可能死亡的危险。
[0007]广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室钟南山院士和孙宝清教授团队发表《肝素结合蛋白水平与重症新冠肺炎病情加重及多器官损伤的关系》，研究表明，HBP在重症新冠
肺炎患者全身炎症反应中起关键作用。纵向分析显示，在器官功能障碍的任何影像学特征出现前5天左右，HBP即升高。因此，监测HBP水平可以作为感染SARS
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COV
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2后新冠肺炎病情加重和多器官损伤的一个有用的生物标志物。
[0008]临床上，通过体外定量检测人血浆样本中肝素结合蛋白(HBP)的含量，可用于重度脓毒症和脓毒性休克的辅助诊断。当然，HBP的测定结果仅供临床参考，不能单独作为诊断或排除病例的依据。
[0009]目前，检测肝素结合蛋白的代表性试剂盒有英国Axis
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shield公司的酶联免疫试剂盒，该试剂盒是在96孔微孔板上包被抗体，加入待测样本后，样本中的HBP抗原与包被抗体，以及酶标记的标记抗体形成免疫复合物，经过洗涤后加入显色底物，酶催化底物产生颜色变化，通过测量特定波长下的吸光度变化，定量检测样本中的HBP浓度。但该试剂盒的ELISA微孔板包被蛋白量有限，进而影响反应后形成免疫夹心复合物的含量，造成该试剂盒的线性范围较窄，且存在操作繁琐，检测时间较长的缺点。
[0010]CN204882574U公开一种胶体金法检测肝素结合蛋白的试剂盒，CN204882575U公开一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白的试剂盒，这两种方法虽然都可以快速检测，但只能进行定性或者半定量的检测，准确度低，无法提供准确度高的结果。
[0011]CN11929443A与CN112255416A均报道了一种化学发光检测试剂，但两种均属于常规的检测原理，且容易受到抗原过剩的影响，造成试剂盒的检测线性范围不够宽，难以满足临床的需要。
[0012]肝素结合蛋白在正常人群中的浓度为10ng/mL以下，但在炎症及严重感染的情况下可达1000ng/mL以上，因此该项目对检测线性范围要求较宽。
[0013]因此，在肝素结合蛋白检测
，现有技术仍对肝素结合蛋白的检测线性范围存在更高的要求，仍需开发一种检测线性范围较宽的肝素结合蛋白免疫测定试剂盒，以满足临床应用的需要。

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测线性范围较宽的肝素结合蛋白免疫测定试剂盒、制备方法及使用方法。
[0015]为实现上述目的，本专利技术提供了一种肝素结合蛋白测定试剂盒，采取以下技术方案：
[0016]一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物；所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物，所述包被抗体标记于所述固相支撑物上；所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物，所述标记抗体标记于所述示踪物上；所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种，以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体；所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对HBP抗原同一表位的抗体；所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂，所述底物为所述示踪物所对应的底物。
[0017]进一步地，所述包被抗体为第一HBP抗体，所述标记抗体为第二HBP抗体，所述第一HBP抗体与第二HBP抗体不具有相同的表位。
[0018]进一步地，所述中和标记物中的微球为乳胶微球，为一种白色微球或有色微球，所述微球的粒径为200
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5000nm，所述乳胶微球表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功
能基团；所述磁珠为超顺磁珠，所述磁珠的粒径为200
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5000nm，所述磁珠的表面修饰有功能基团，所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。
[0019]进一步地，所述固相支撑物选自微孔板或磁珠，所述微孔板由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成，所述磁珠为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物；所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物，所述包被抗体标记于所述固相支撑物上；所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物，所述标记抗体标记于所述示踪物上；所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种，以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体；所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对HBP抗原同一表位的抗体；所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂，所述底物为所述示踪物所对应的底物。2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述包被抗体为第一HBP抗体，所述标记抗体为第二HBP抗体，所述第一HBP抗体与第二HBP抗体不具有相同的表位。3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述中和标记物中的微球为乳胶微球，为一种白色微球或有色微球，所述微球的粒径为200
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5000nm，所述乳胶微球表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团；所述磁珠为超顺磁珠，所述磁珠的粒径为200
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5000nm，所述磁珠的表面修饰有功能基团，所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述固相支撑物选自微孔板或磁珠，所述微孔板由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成，所述磁珠为超顺磁珠，所述磁珠的粒径为200
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5000nm，所述磁珠的表面修饰有功能基团，所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。5.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述所述示踪物包括酶或发光物质，所述酶选自碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，所述发光物质选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物或三联吡啶钌中的一种。6.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足以下工作浓度：固相标记物的工作浓度为0.1mg/mL～1.0mg/mL；微孔板固相包被浓度为0.5
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5μg/mL；示踪标记物的工作浓度为0.1μg/mL～5.0μg/mL；中和标记物的工作浓度为0.2μg/mL～8μg/mL。7.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述固相标记物中标记抗体的浓度为5～100μg抗体/mg磁珠；所述示踪标记物中标记抗体与示踪物的比例为1:1～1:50；所述中和标记物中标记抗体的浓度为5～100μg抗体/mg微球或磁珠。8.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述肝素结合蛋白测定试剂盒的检测线性范围为10
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1500ng/mL，所述肝素结合蛋白测定试剂盒的最低检测限度为不大于0.2ng/mL。9.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将HBP包被抗体包被到磁珠或微孔板上，得到固相标记物；(2)将HBP标记抗体标记到微球或磁珠上，得到中和标记物；(3)将HBP标记抗体标记到示踪物上，得到示踪标记物；(4)将固相标记物、中和标记物、示踪标记物、清洗液及底物组装得到试剂盒。
10.根据权利要求9所述的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述固相标记物的制备方法，包括以下步骤：(1)将10
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40mg磁珠采用偶联缓冲液清洗，磁性分离，弃上清，再用偶联缓冲液复溶，混匀静置，所述偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴辉，徐剑文，向艳丽，骆昡，陆春，范凯，
申请(专利权)人：深圳市爱康试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：