一种免疫磁珠及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种免疫磁珠及其制备方法和应用，该免疫磁珠(IMNs)选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获，与单一适体作为识别CTCs的标志物相比，可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上。本发明专利技术制备的免疫磁珠(IMNs)与待捕获的CTCs具有良好的生物相溶性，可以主动捕获目标细胞，并通过降解DNA适配体链而被清除，使得目标细胞易于释放，其制备方法简单，反应条件温和，成本低，适用范围广，可以富集、分离和检测循环胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞。肺癌细胞或肝癌细胞。肺癌细胞或肝癌细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫磁珠及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种免疫磁珠，以及该免疫磁珠的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)是从肿瘤中释放到血液中的罕见癌细胞，被认为是肿瘤侵袭的标志物，包含 肿瘤发生和转移的所有实时分子信息，在肿瘤转移中起着关键作用。同时，作为一种液体活检技术， CTCs检测能够减少侵入组织取样需求的机会，在肿瘤治疗的基础研究和临床应用方面具有很大的潜 力。因此，定量检测患者血液中的CTCs，将为恶性肿瘤的早期诊断、临床治疗、复发检测及预后提 供及时有价值的信息。
[0003]由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故捕获效率及纯度一直是限制循环肿瘤细胞研究的 重要因素，目前大多数方法无法同时达到高效率及高纯度的捕获与检测。目前CellSearch系统是美国 FDA批准的唯一用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的临床CTCs检测技术，其主要原理是利用 偶联了EpCAM抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，从而捕获细胞。然而，该系统的主要缺 陷是只能单独识别捕获表达EpCAM的CTCs，对于一些不表达或低EpCAM的CTCs，则无法有效获 取。此外，在该系统中，捕获的CTCs会失去了原有的活力，而且抗体成本昂贵，操作繁琐。
[0004]由于目前CTC捕获效率不能达到百分百，而且常见的CTC捕获方法在灵敏度、特异性、时间和 成本等方面存在一定的缺陷，因此，制备既能够有效增强与CTCs的识别结合，同时又能操作简便、 成本低的免疫磁珠是检测和表征CTCs的关键步骤。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种免疫磁珠(IMNs)，选择以EpCAM适体和PTK7 适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获，与单一适体作 为识别CTCs的标志物相比，可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高， 达到90％以上。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种上述免疫磁珠的制备方法。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供一种上述免疫磁珠在富集和分离循环肿瘤细胞中的应用。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种免疫磁珠，它包括羧基化Fe3O4纳米球、链霉亲和素和链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米 球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体。
[0010]其中，PTK7适体，即酪氨酸蛋白激酶7，是PTK7/Otk的一个具有多功能的共同受体，最早是在 结肠癌细胞中发现的，在结肠癌、食管癌、乳腺癌、血液等疾病中过表达。
[0011]EpCAM适体，即上皮细胞黏附分子，是一种在上皮源性肿瘤细胞表面广泛表达的糖蛋白，具有 很强的抗原表位，在肝癌、结直肠癌、胃癌等中高表达。
[0012]偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。
[0013]本专利技术提供的免疫磁珠(IMNs)，采用链霉亲和素对羧基化Fe3O4纳米球进行修饰，然后在修饰 后的羧基化Fe3O4纳米球上偶联用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体， 使得制成的免疫磁珠(IMNs)可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很 高，达到90％以上。
[0014]本专利技术提供的免疫磁珠(IMNs)，与待捕获的CTCs具有良好的生物相溶性，可以主动捕获目标 细胞，并通过降解DNA适配体链而被清除，这使得目标细胞易于释放，得以体外培养和分析。
[0015]在一种优选方案中，本专利技术提供的免疫磁珠的粒径为140～180nm，优选为150nm。
[0016]本专利技术选择羧基化Fe3O4纳米球作为捕获CTCs的一个载体，在磁性分离过程中的响应速度更快， 在外加磁场的定向控制下，通过清洗和解吸操作，可将目标物从多组分环境中快速分离出来。
[0017]本专利技术选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应 对CTCs进行富集与捕获。相对于单个标志物捕获的单一性，通过两种标志物联合检测，提高了对CTCs 的特异性识别及捕获效率，富集效率达到90％以上，取得了出人意料的捕获效率。
[0018]本专利技术还提供了上述免疫磁珠的制备方法，它包括如下步骤：
[0019](1)羧基化Fe3O4纳米球的制备：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠和醋酸钠溶于乙醇中，在180～220℃ 的条件下进行化学反应，获得羧基化Fe3O4纳米球；
[0020](2)链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球的制备：将EDC分散于MEST溶液中制备EDC溶液， NHS分散于MEST溶液中制备NHS溶液；然后将配制好的EDC溶液、NHS溶液和步骤(1)中制备 的羧基化Fe3O4纳米球在20～30℃的条件下进行活化反应，待活化反应完成后，再向其中加入链霉亲 和素在20～30℃的条件下进行化学反应，获得链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球；
[0021]其中，MEST溶液为含MES和Tween 20的混合溶液，在混合溶液中MES的浓度为100mM，Tween 20的含量为0.05％，在配制的过程中调节其pH至5.0；
[0022](3)免疫磁珠的制备：将步骤(2)中制备的链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球与PTK7适 体和EpCAM适体进行偶联反应，获得免疫磁珠。
[0023]在步骤(1)中，无水三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.15～0.25，可以但不局限于1:0.15、1:0.16、 1:0.17、1:0.18、1:0.19、1:0.20、1:0.21、1:0.22、1:0.23、1:0.24或1:0.25，为了获取更好的效果，无水 三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.19。
[0024]进一步地，在步骤(1)中，无水三氯化铁与醋酸钠的质量比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、 1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获取更好的效果，无水三氯化铁与醋酸钠的质 量比为1:1.1。
[0025]对于本专利技术而言，在步骤(1)中，反应温度为180～220℃，可以但不局限于180℃、190℃、200℃、 205℃、210℃或220℃。
[0026]进一步地，反应时间为6～12小时，可以但不局限于6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、 11小时或12小时。
[0027]在步骤(1)中，可以采用不锈钢高压反应釜作为反应设备制备羧基化Fe3O4纳米球。
待反应结束 后，将得到的羧基化Fe3O4纳米球采用无水乙醇洗涤、干燥后，置于冰箱中备用。在使用之前，先进 行超声分散处理，然后用PBS缓冲液制成含羧基化Fe3O4磁珠的溶液，其中，羧基化Fe3O4磁珠的浓 度可以根据需要进行调整，其浓度可以为80～120mg/ml，例如，100mg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫磁珠，其特征在于，它包括羧基化Fe3O4纳米球、链霉亲和素和链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体。2.根据权利要求1中的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的粒径为140～180nm，优选为150nm。3.一种权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)羧基化Fe3O4纳米球的制备：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠和醋酸钠溶于乙醇中，在180～220℃的条件下进行化学反应，获得羧基化Fe3O4纳米球；(2)链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球的制备：将EDC分散于MEST溶液中制备EDC溶液，NHS分散于MEST溶液中制备NHS溶液；然后将配制好的EDC溶液、NHS溶液和步骤(1)中制备的羧基化Fe3O4纳米球在20～30℃的条件下进行活化反应，待活化反应完成后，再向其中加入链霉亲和素在20～30℃的条件下进行化学反应，获得链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球；其中，MEST溶液为含MES和Tween 20的混合溶液，在混合溶液中MES的浓度为100mM，Tween20的含量为0.05％，在配制的过程中调节其pH至5.0；(3)免疫磁珠的制备：将步骤(2)中制备的链霉亲和素修饰的羧基化Fe3O4纳米球与PTK7适体和EpCAM适体进行偶联反应，获得免疫磁珠。4.根据权利要求3所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述无水三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.15～0.25，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成林，印晓星，贡淑媛，李瑞，于妍妍，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：