用于合成5制造技术

本文提供用于合成5

【技术实现步骤摘要】
用于合成5
’‑
加帽RNA的组合物和方法
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日是2016年9月20日，申请号为2016800674586 (PCT/US2016/052670)，专利技术名称为“用于合成5
’‑
加帽RNA的组合物和方法”。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2015年9月21日提交的美国临时申请号62/221，248的优先权，在此 其内容其整体通过引用并入本文。
[0004]序列表
[0005]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表并且其整体在此通过引用并入本文。 所述ASCII复本于2016年11月16日创建，其名称为095109
‑
000500PC
‑
1022543_SL.txt 且大小为785字节。
专利

[0006]本专利技术涉及用于合成5
’
加帽RNA的方法和组合物。在具体方面，本专利技术涉及新型含
ꢀ“
帽”起始寡核苷酸引物，其具有天然的的或修饰的5
’‑
帽0、帽1、帽2或三甲基鸟苷
‑ꢀ
帽(TMG
‑
帽)结构。在其他的方面，本专利技术涉及提供用于有效地产生其和使用其制备5
’‑ꢀ
加帽RNA的方法。

技术介绍

[0007]提供以下描述以帮助读者的理解。所提供的信息或引用的参考文献都不被承认是本发 明的现有技术。
[0008]编码用于治疗应用的生理上重要的蛋白质的信使RNA(mRNA)相对于基于DNA的 质粒和病毒载体对于递送遗传物质已经显示出显著优势。这些优势中最重要的是：
[0009](i)高的安全水平(降低来自病毒或质粒整合的潜在的基因组损害)，
[0010](ii)mRNA递送导致立即蛋白质表达(不像一般伴随质粒发生的延迟响应)，
[0011](iii)mRNA允许对蛋白质表达的稳健剂量依赖性控制，以及
[0012](iv)与制造质粒和病毒载体相比，大规模合成mRNA的简单性。
[0013]信使RNA可以编码实质上任何已知的蛋白质并可以通过本领域技术人员已知的多种 方法递送至特定的组织和器官。一旦被递送，这些mRNA指导目标组织内的核糖体蛋白质 表达，导致按照mRNA分子生产数百种蛋白质。
[0014]存在于每个活性mRNA分子中的几个结构元件被利用以有效地翻译编码的蛋白质。这 些元件的一个是在mRNA的5
’‑
末端上的帽结构，其存在于所有真核生物(和一些病毒) 中。天然存在的帽结构包含在鸟嘌呤碱基的N7位甲基化的核糖鸟苷残基。此7
‑
甲基鸟苷 (
7m
G)通过5
’‑
至5
’‑
三磷酸链连接在mRNA分子的5
′‑
末端贯穿本申请，7m和m7可互换 使用，具有同等含义。5
’‑
末端上
7m
Gppp片段的存在对于mRNA成熟至关重要，其：
[0015]保护mRNA免于被核酸外切酶降解，
[0016]促进mRNA从核转运至细胞质，以及
[0017]在翻译起始复合体的装配中起关键作用(Cell 9:645
‑
653,(1976)；Nature 266:
235, (1977)；Federation of Experimental Biologists Society Letter 96:1
‑
11,(1978)；Cell 40:223
‑
24, (1985)；Prog.Nuc.Acid Res.35:173
‑
207,(1988)；Ann.Rev.Biochem.68：913
‑
963,(1999)；J. Biol.Chem.274:30337
‑
3040,(1999))。
[0018]只有那些携带帽结构的mRNA在帽依赖性翻译中具有活性；mRNA的“去帽 (decapitation)”导致其对于蛋白质合成的模板活性几乎完全失去(Nature,255:33
‑
37, (1975)；J.Biol.Chem.,vol.253:5228
‑
5231,(1978)；and Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72: 1189
‑
1193,(1975)).
[0019]真核mRNA的另一个元件是在转录物位置1(帽1)处存在2
’‑
O
‑
甲基核苷残基，以及 在某些情况下在转录物位置1和2(帽2)处存在2
’‑
O
‑
甲基核苷残基。mRNA的2
’‑
O
‑
甲 基化对于在体内mRNA翻译的更高效力而言是需要的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77: 3952
‑
3956(1980))并且进一步提高5
’‑
加帽mRNA的核酸酶稳定性。具有帽1(和帽2) 的mRNA为独特的标志，其允许细胞识别真正的mRNA 5
′
末端，并且在一些情况下，区别 于源自感染性遗传元件的转录物(Nucleic Acid Research 43:482
–
492(2015))。
[0020]初级(primary)mRNA转录物携带在体内始于NTP(一般GTP)的RNA合成起始(起 动，initiation)导致的5
’‑
三磷酸基团(5
’‑
pppmRNA)。通过几个酶促步骤发生mRNA转录 物的5
′‑
三磷酸化末端向帽结构(帽0)的转化(J.Biol.Chem.250:9322,(1975)；J.Biol.Chem. 271：11936,(1996)；J.Biol.Chem.267:16430,(1992))。这些酶促反应步骤包括：
[0021]步骤1：RNA三磷酸酶使mRNA的5
′‑
三磷酸基转化为5
’‑
二磷酸基， pppN1(pN)
x
→
ppN1(pN)
x
+无机磷酸根；
[0022]步骤2：RNA鸟苷酸转移酶利用GTP将GMP残基转移至mRNA的5
′‑
二磷酸基， ppN1(pN)
x
+GTP
→
G(5
′
)ppp(5
′
)N1(pN)
x
+无机焦磷酸根；以及
[0023]步骤3：鸟嘌呤
‑7‑
甲基转移酶利用S
‑
腺苷
‑
甲硫氨酸(AdoMet)作为辅因子并将甲基 从AdoMet转移至鸟嘌呤碱基的7<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.起始加帽寡核苷酸引物，其包含以下结构：其中：B1至B
10
中的每一个独立地为天然的、修饰的或非天然的核苷碱基；M为0或1；L为0或1；q1为1并且q2至q9中的每一个独立地为0或1；R1为H或甲基；R2和R3独立地为H、OH、烷基、O
‑
烷基、卤素、连接体或可检测标志物；X1至X
13
中的每一个独立地为O或S；Y1至Y
13
中的每一个独立地为OH、SH、BH3、芳基、烷基、O
‑
烷基或O
‑
芳基；Z1至Z
22
中的每一个独立地为O、S、NH、CH2、C(卤素)2或CH(卤素)；以及R4至R
12
中的每一个独立地为H、OH、OMe或可检测标志物。2.根据权利要求1所述的起始加帽寡核苷酸引物，其中：
q1＝1，以及q2
‑
q9中的每一个＝0或1。3.根据权利要求1或2所述的起始加帽寡核苷酸引物，其中：B1与核酸模板上转录模板位置+1处的核苷碱基完全互补，B2至B9，如果存在，与核酸模板上转录开始位点处从位置+2开始的对应核苷碱基完全互补，以及B
10
，起始加帽寡核苷酸引物的最后一个核苷碱基，与最后一个杂交转录模板核苷酸完全互补。4.根据权利要求1所述的起始加帽寡核苷酸引物，其中：q2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：垂林克生物技术公司，
类型：发明
国别省市：