一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用，属于分子生物学和核酸检测技术领域。本发明专利技术通过设计一种新型分子信标探针，分子信标探针至少包括两条分子信标探针，分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5

【技术实现步骤摘要】
一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和核酸检测
，具体涉及一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]体外转录是指在体外无细胞体系中，以包含启动子区域的线性DNA为模板，添加RNA聚合酶和NTP等条件，模仿体内转录生成RNA的过程。体外转录系统可以方便准确的检测目的基因启动子的转录活性，特异性检测转录调控蛋白、配体分子或金属离子对启动子转录的影响，广泛应用于分子生物学领域中转录机制、转录元件及转录因子的研究。
[0004]体外转录活性的检测聚焦于转录体系中产物RNA的定量。由于微体积体外转录系统中RNA的产量极低，如何特异且灵敏地检测生成的转录产物是分子生物学的一个重要问题。目前检测产物RNA的方法有Northern印迹杂交法、荧光实时逆转录PCR定量法和α
‑
32
P标记的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。然而这些方法的应用存在着许多局限。Northern印迹杂交法是指在变性条件下将RNA样品进行凝胶电泳，再将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，最后使用标记探针进行杂交，经放射自显影或酶反应显色的过程。此过程大约需要两天的周期，且实验误差较大、对显影仪器要求较高。荧光实时逆转录PCR定量法即在体外转录反应后，使用DNase I将DNA模板完全降解，生成的RNA经反转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行荧光定量PCR的过程。此过程灵敏度高且无需同位素标记，然而检测过程繁琐且易受体系残留DNA模板的干扰。α
‑
32
P标记的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法是指在体外转录体系中添加α
‑
32
P标记的NTP混合物，使合成的RNA 带有同位素标记，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离靶标RNA，经磷屏扫描仪扫描定量的过程。此过程操作相对简单且灵敏度高，是目前微量体外转录活性检测的常用方法。然而α
‑
32
P标记试剂的高成本性和贯穿全实验周期的放射性防护操作，为本方法的应用带来许多不便。且以上所有方法均是体外转录反应的转录后终点法检测，无法实现启动子活性的实时示踪。
[0005]分子信标(Molecular beacon，MB)技术是一种基于荧光共振能量转移现象和碱基互补配对原则建立起来的分析技术。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和灵敏度，且无毒无害，对环境无污染。传统分子信标含有25～35个核苷酸，包括环状区、颈环区、荧光基团和猝灭基团，可应用于RNA提纯后的含量测定。其原理为：自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光基团和淬灭基团相距较近。由于荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全淬灭，荧光本底极低。当分子信标与RNA结合时，分子信标的颈环区打开，此时荧光基团和淬灭基团之间距离增加，至使分子信标荧光恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶标RNA量成正比。然而，专利技术人
发现，在体外转录体系中，RNA 聚合酶和转录调控因子等DNA结合蛋白可与分子信标DNA结合并干扰信标荧光恢复，限制了传统分子信标在体外转录检测中的应用。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用。本专利技术通过设计一种新型分子信标探针，利用该新型分子信标探针进行体外转录活性检测，可以实现单启动子或多启动子转录活性的实时定量示踪检测。该方法无需进行产物RNA的纯化，无需每次单独设计合成探针，具有易于操作、经济快速、环境友好、结果稳定性好且易于分析的优势。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种分子信标探针，所述分子信标探针至少包括两条分子信标探针，所述分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5
’
端或5
’
端标记有荧光基团，第二分子信标探针的近3
’
端或3
’
端标记有猝灭基团。
[0009]所述分子信标探针的序列长度均控制为15～50bp；
[0010]所述分子信标探针中的G和C碱基含量控制为30～80％；
[0011]分子信标探针的Tm值控制为30～90℃。
[0012]所述第一分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的3
’
端，与第二分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的5
’
端相临。
[0013]本专利技术对荧光基团和猝灭基团不做具体限定，本领域技术人员可通过现有知识选择。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述荧光基团包括但不限于FAM、ROX或VIC；所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2或TAMRA。
[0014]需要说明的是，当本专利技术中分子信标探针使用部分荧光基团和猝灭基团时(如FAM和TAMRA)，当近距离接触时，猝灭基团(如TAMRA)不仅可以导致荧光基团(如FAM)荧光猝灭，还可以通过能量共振转移吸收部分能量，导致自身荧光激发。因此，在体外转录体系中不仅可以检测荧光基团信号的猝灭，还可以检测猝灭基团信号的增强。
[0015]本专利技术的新型分子信标探针的工作原理具体为：在体外转录初期，第一分子信标探针和第二分子信标探针在溶液中游离，荧光基团和猝灭基团距离较远，体系中检测到的荧光信号较高；随着体外转录的进行，第一分子信标探针和第二分子信标探针均与产物RNA互补配对结合，荧光基团和淬灭基团相距较近，此时荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，体系中荧光信号下降，且荧光信号的下降值与体系中产物RNA的含量成正比。(图1)
[0016]本专利技术的第二个方面，提供一种体外转录检测试剂盒，所述试剂盒包括上述分子信标探针。
[0017]所述试剂盒还可以包括用于对体外转录进行荧光检测的其他组分，包括但不限于缓冲液(如5
×
Transcription Buffer)、DNA模板、RNA聚合酶全酶、NTPs和RNAse free H2O。
[0018]本专利技术的第三个方面，提供上述分子信标探针和/或体外转录检测试剂盒在体外转录活性检测中的应用。从而可以实现体外转录反应的无污染、高时效、高灵敏度和高特异性实时示踪检测。
[0019]具体的，所述应用包括：对转录体系中产物RNA的定量检测。
[0020]所述定量检测可以是相对定量检测或绝对定量检测。
[0021]当进行绝对定量检测时，可通过对探针标准曲线的测定完成。
[0022]同时，需要说明的是，通过同时使用两组或两组以上分子信标探针，本专利技术显然可以实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针至少包括两条分子信标探针，所述分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5
’
端或5
’
端标记有荧光基团，第二分子信标探针的近3
’
端或3
’
端标记有猝灭基团。2.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的序列长度均控制为15～50bp；所述分子信标探针中的G和C碱基含量控制为30～80％；分子信标探针的Tm值控制为30～90℃。3.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，第一分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的3
’
端，与第二分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的5
’
端相临。4.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述荧光基团包括但不限于FAM、ROX或VIC；所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2或TAMRA。5.一种体外转录检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1
‑
4任一项所述分子信...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷立川，张冯瑜，王晓萌，张坤迪，王宏伟，许素娟，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：