一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用。该DNAzyme探针，包含酶链H1、底物链H2、酶链H3和底物链H4。该DNAzyme探针可以特异性识别目标核酸，实现基于DNAzyme的指数级信号放大，反应动力学提高，检测限降低，仅为0.15fM，相比传统的DNAzyme探针检测限降低了3个数量级(传统的DNAzyme探针检测限为0.2pM)，同时，检测灵敏度比传统的DNAzyme探针提高了1333倍，即本发明专利技术提供的DNAzyme探针灵敏度高、检测限低、特异性强。并且具有更优的反应动力学。并且具有更优的反应动力学。

【技术实现步骤摘要】
一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的，长度约为19
‑
22个碱基的的非编码短链RNA，可以调节多种生物过程，包括细胞分化，细胞增殖和凋亡等。miRNAs的异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关，因此，miRNA被作为癌症的诊断标志物和治疗靶点。发展miRNA的高灵敏高特异性定量检测方法对疾病诊断和了解疾病的发生发展至关重要，特别是活细胞内miRNA的成像更具吸引力，因为其可以避免复杂的提取过程，保证细胞的活性，且能为癌症相关miRNAs表达的研究提供可视化时间和空间方面的信息。
[0003]miRNA的表达水平较低，且同源相似度高。实现高灵敏高特异性miRNA分析是一大难点。基于此，研究者提出了多种恒温核酸扩增技术用于构建更高灵敏度的检测方法，如滚环扩增(RCA)、环介导指数扩增(LAMP)、恒温指数扩增(EXPAR)，这些酶参与的扩增方法效率高，但生物酶昂贵且受检测环境影响较大，检测准确度较低。同时生物酶难以转染进活细胞，这些方法不适用于活细胞内miRNA分析。无酶参与的恒温扩增包括杂交链反应(HCR)、催化发夹自组装反应(CHA)和DNAzyme切割扩增反应等，这些方法摆脱了生物酶的干扰，准确度高，被广泛用于细胞内外核酸分析，其中DNAzyme切割扩增反应由于较低的背景信号和较快的反应速率受到较多的关注。r/>[0004]DNAzyme是一类在金属离子存在的条件下特异性切割底物RNA链的脱氧核苷酸，具有无限切割底物和可循环靶标回收特点，已被广泛应用于构建一对多的信号放大策略。然而目前的DNAzyme扩增主要是线性扩增模式，切割效率低下，成像灵敏度相对较低，无法满足活细胞内的低表达水平miRNA的原位成像分析。虽然许多研究者通过将DNAzyme与RCA,CHA,HCR等联合使用以提高方法的扩增效率，但是这些方法存在设计复杂、耗时、操作困难等缺陷且方法大多仍为简单线性扩增的级联，扩增效率仍然有待提高，发展更高扩增效率的miRNA分析方法仍旧是一大挑战。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面的目的，在于提供一组检测核酸的DNAzyme探针。
[0006]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米颗粒。
[0007]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米颗粒的制备方法。
[0008]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种检测核酸的试剂盒。
[0009]本专利技术第五方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的DNAzyme探针、本专利技术第二方面的纳米颗粒、或第四方面的试剂盒在非疾病诊断用途的核酸检测中的应用。
[0010]本专利技术第六方面的目的，在于提供一种非疾病诊断用途的核酸检测方法。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一个方面，提供一组检测核酸的DNAzyme探针，包含：酶链H1、底物链H2、酶链H3和底物链H4；
[0013]所述酶链H1从5
’
到3
’
依次包括：A序列、B序列、C序列、D序列和E序列；
[0014]所述E序列与目标核酸互补；
[0015]所述D序列为TAG、AAG、ATG、TTG或GCG；优选地，所述D序列为TAG；
[0016]所述C序列为ATAGTGGG、AAAGTGGG、ATAGTGGG、TTAGTGGG或GCAGTGGG；优选地，所述C序列为ATAGTGGG；
[0017]所述B序列为基于DNAzyme探针对应金属离子的DNAzyme催化活性中心；
[0018]所述A序列与E序列5
’
端的第2～18位碱基互补；
[0019]所述底物链H2从5
’
到3
’
依次包括：F序列、G序列、H序列、I序列和J序列；
[0020]所述F序列为ACCAGCCGCAAAT(SEQ ID NO.13)或ATAGGGTCATGCT(SEQ ID NO.14)；
[0021]所述G序列与所述C序列互补；
[0022]所述H序列为两个核糖核苷酸；优选地，所述H序列为rA rG，rA为腺嘌呤核苷酸，rG为鸟嘌呤核苷酸；
[0023]所述I序列与所述A序列的3
’
端互补配对；优选地，所述I序列与所述A序列的3
’
端的第1～8位碱基互补；
[0024]所述J序列与所述F序列及G序列的第一位碱基连接而成的序列互补；
[0025]所述底物链H2的5
’
端和3
’
端分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团；
[0026]所述酶链H3从5
’
到3
’
依次包括：K序列、B序列、L序列、M序列和N序列；
[0027]所述N序列与所述F序列与所述G序列连接而成的序列互补；
[0028]所述M序列为TTTAT；
[0029]所述L序列与目标核酸的3
’
端互补；优选地，所述L序列与目标核酸的3
’
端的第1～9位碱基互补；
[0030]所述K序列与所述M序列3
’
端的第1位碱基与所述N序列5
’
端的第1～16位碱基连接而成的序列互补；
[0031]所述底物链H4从5
’
到3
’
依次包括：O序列、H序列、P序列和Q序列；
[0032]所述O序列与所述E序列互补；
[0033]所述P序列与所述K序列的3
’
端互补；优选地，所述P序列与所述K序列的3
’
端的第1～8位碱基互补；
[0034]所述Q序列与所述目标核酸的5
’
端的第1～17位碱基互补；
[0035]所述底物链H4的5
’
端和3
’
端分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团。
[0036]优选地，所述金属离子为锌离子、锰离子和铜离子中的至少一种。
[0037]优选地，所述金属离子为锌离子时，所述B序列为TCCGAGCCGGTCGAA(SEQ ID NO.15)。
[0038]优选地，所述金属离子为锰离子时，所述B序列为AGGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO.16)。
[0039]优选地，所述金属离子为铜离子时，所述B序列为GCCTGGGCCTCTTTCT(SEQ ID NO.17)。
[0040]优选地，所述荧光基团为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料
Cy5、ROX、FITC和花青素荧光染料Cy5.5中的一种。
[0041]优选地，所述荧光淬灭基团为荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组检测核酸的DNAzyme探针，包含：酶链H1、底物链H2、酶链H3和底物链H4；所述酶链H1从5
’
到3
’
依次包括：A序列、B序列、C序列、D序列和E序列；所述E序列与目标核酸互补；所述D序列为TAG、AAG、ATG、TTG或GCG；所述C序列为ATAGTGGG、AAAGTGGG、ATAGTGGG、TTAGTGGG或GCAGTGGG；所述B序列为基于DNAzyme探针对应金属离子的DNAzyme催化活性中心；所述A序列与E序列5
’
端的第2～18位碱基互补；所述底物链H2从5
’
到3
’
依次包括：F序列、G序列、H序列、I序列和J序列；所述F序列为ACCAGCCGCAAAT(SEQ ID NO.13)或ATAGGGTCATGCT(SEQ ID NO.14)；所述G序列与所述C序列互补；所述H序列为两个核糖核苷酸；所述I序列与所述A序列的3
’
端互补配对；所述J序列与所述F序列及G序列的第一位碱基连接而成的序列互补；所述底物链H2的5
’
端和3
’
端分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团；所述酶链H3从5
’
到3
’
依次包括：K序列、B序列、L序列、M序列和N序列；所述N序列与所述F序列与所述G序列连接而成的序列互补；所述M序列为TTTAT；所述L序列与目标核酸的3
’
端互补；所述K序列与所述M序列3
’
端的第1位碱基与所述N序列5
’
端的第1～16位碱基连接而成的序列互补；所述底物链H4从5
’
到3
’
依次包括：O序列、H序列、P序列和Q序列；所述O序列与所述E序列互补；所述P序列与所述K序列的3
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端互补；所述Q序列与所述目标核酸的5
’
端的第1～17位碱基互补；所述底物链H4的5
’
端和3
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端分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的检测核酸的DNAzyme探针，其特征在于：所述金属离子为锌离子、锰离子和铜离子中的至少一种。3.根据权利要求2所述的检测核酸的DNAzyme探针，其特征在于：所述核酸为miR
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373，所述金属离子为锌离子时，所述酶链H1的序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊，黄婷，陈金香，谢宝平，段文军，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：