同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于捕获同源重组修复基因的探针组，该探针组捕获的基因组区域主要包括ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L这15个前列腺癌相关的同源重组修复基因的全编码区和外显子

【技术实现步骤摘要】
同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及同源重组修复（HRR）基因的检测，更具体地说，是涉及前列腺癌同源重组修复基因突变的检测方法，以及用于该检测方法的杂交捕获探针组和试剂盒。

技术介绍

[0002]高通量测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术，又名下一代测序技术或二代测序技术，一次可以检测大量靶基因及其变异位点，检测灵敏度和特异性高，兼具定性和定量检测，且检测所需组织样本更少，速度更快，成本更低。NGS，尤其是基于杂交捕获或靶向扩增技术的NGS，集多种优势，让研究者们更易于实现他们的目标。
[0003]基因Panel（将若干基因对应的探针设计在一起以捕获目标DNA并用于后续的基因测序）可以帮助临床医生对癌症患者进行分型，并可帮助制定合理的治疗方案。与其他的检测相比，基于NGS的基因panel检测可以在较短的周期内一次性检测多个基因，价格也相对合理，肿瘤专家可以根据每个患者肿瘤的DNA测序结果制定靶向治疗方案。近年来，随着肿瘤基因靶向药物与免疫治疗的广泛运用，通过对多种基因进行平行测序，可以为临床医生提供有意义的多种关键信息，制定更适用的治疗方案。
[0004]细胞在正常的代谢过程中由于各种因素的影响会导致DNA损伤，然后触发DNA的保护机制对损伤DNA进行修复。同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）是DNA损伤修复的核心方式之一，是维持基因组完整性、确保遗传信息高保真传递的一种DNA修复机制。HRR是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路，其中关键蛋白为BRCA1和BRCA2。如果BRCA基因出现突变导致BRCA1和BRCA2蛋白失去功能，就会引起HRR功能异常（Homologous Recombination Deficiency，HRD）。另外，其它HRR相关基因，如PALB2、CDK12、RAD51、CHEK2、ATM等发生突变，或BRCA1基因启动子发生甲基化以及其他暂未明确的原因，都会引起HRD，导致基因组不稳定。HRR通路紊乱是多种类型癌症的基础，其复杂的过程涉及多种基因，在多种肿瘤中发挥并扮演重要的角色，HRR能力强弱可能是体细胞突变及相应的多种类型肿瘤的主要诱因，如BRCA1/2与乳腺癌、卵巢癌，RAD54与非霍奇金淋巴瘤，RECQL4与骨肉瘤和皮肤癌。
[0005]I型多聚ADP
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核糖聚合酶(PARP
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1)是一种在DNA损伤修复和细胞凋亡中都发挥重要作用的修饰酶。BRCA1基因和BRCA2基因发生突变的肿瘤细胞往往依赖PARP
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1完成对DNA损伤的修复。因此，PARP抑制剂能够通过抑制PARP
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1的功能来抑制肿瘤细胞DNA的损伤修复。奥拉帕利作为一种非常重要的PARP抑制剂，被美国食品药品管理局（FDA）在2018年批准用于存在有害或疑似有害生殖系或体细胞BRCA突变（gBRCAm或sBRCAm）晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者（其在接受一线铂类化疗后达到完全或部分缓解后的一线维持治疗），在2019年批准用于胚系突变转移性胰腺癌患者的维持治疗。在2020年，奥拉帕利又被批准用于治疗存在同源重组修复（HRR）基因突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。本项批准基于奥拉帕利Ⅲ期PROfound临床试验的结果。在PROfound试验中，对于
存在BRCA或ATM突变的男性患者，与医生选择的恩杂鲁胺或阿比特龙相比，奥拉帕利可延长患者中位影像学无进展生存期一倍以上，是目前研究证实唯一可延长患者总生存期的PARP抑制剂。这些结果凸显了基因组检测对帮助该疾病男性患者确定治疗方案的重要性。奥拉帕利本次获批的适应症是治疗既往经新型内分泌药物治疗后，存在有害或疑似有害胚系或体系HRR基因突变的mCRPC患者。患者需事先接受FDA批准的试剂盒进行基因检测，HRR基因突变阳性的患者可以使用奥拉帕利治疗。目前，奥拉帕利正在欧盟和其他司法管辖区接受监管审批，以用于治疗HRR基因突变的mCRPC患者。
[0006]HRR是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路，涉及的基因已知的就已多达数十个。HRR基因的突变类型包括点突变、插入/缺失、DNA拷贝数变异和大片段重排等，其突变的检测存在一定难度，因此，建立准确、可靠、灵敏的检测方法具有十分重要的意义。
[0007]目前华大基因开发的基于二代测序的BRCA1/2基因突变检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)，可用于对临床确诊为卵巢癌及乳腺癌患者的BRCA1/2基因外显子区以及邻近内含子区的胚系变异进行定性检测。
[0008]艾德生物开发了人类BRCA1基因和BRCA2基因突变检测试剂盒（可逆末端终止测序法），经国家药品监督管理局（NMPA）批准，可用于PARP抑制剂奥拉帕利片的相关用药指导。该试剂盒定性检测BRCA1/BRCA2基因全的编码区及外显子
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内含子连接区、UTR区和启动子区的点突变和插入缺失，但不包括大片段缺失和拷贝数变异。
[0009]上述两个试剂盒主要涉及BRCA1、BRCA2基因外显子区域以及邻近内含子区域，而且仅检测目标区域内BRCA的胚系突变，没有考虑BRCA1、BRCA2的内含子区域和通路上的其它基因，并且没有包含体系突变和全部的突变类型。
[0010]已有大量的研究表明，发生在内含子区域的大片段的重排对BRCA1、BRCA2的正常生物功能会产生影响，基因捕获区域的增加，会提高检测的准确性。另外，研究证实，HRR通路上的其它基因也扮演重要的角色，ATM基因蛋白已经成为PARP抑制剂的靶点之一；RAD51产生的蛋白与单链和双链DNA结合，催化同源DNA间的识别和链交换，在同源重组修复过程中发挥重要功能；RAD51 foci无法形成是同源重组修复通路失效细胞的特征之一。每一个HRR通路上的基因的失效都有可能导致基因组不稳定的发生。
[0011]然而目前市面上的HRR基因二代测序产品，普遍存在以下问题：1）涉及基因少，包含的目标区域不完整，影响科研探索，对新靶点的发现功能有限；2）检测的突变类型单一，不涉及大片段重排和拷贝数变异的检测，且不包含体系突变，影响检测的阳性；3）不涉及样本污染质控，缺乏重要的质控指标。
[0012]因此，在同源重组修复基因检测领域，迫切需要更具针对性的基因panel。如果panel的基因选取不当，或者基因位点或区域选取不当，错失重要位点的信息，对患者就不能起到针对性的检查，不仅增加患者的成本，而且没有指导作用。

技术实现思路

[0013]本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种用于捕获同源重组修复基因的探针组，该探针组的基因覆盖度广，可检测的HRR基因突变类型全。
[0014]为解决上述技术问题，本专利技术的用于捕获同源重组修复基因的探针组，设计的捕获基因组区域主要包括表1中的15个同源重组修复基因（ATM、BARD1、BRCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于捕获同源重组修复基因的探针组，其特征在于，所述探针组捕获的基因组区域包括：表1中所示的15个同源重组修复基因的全编码区和外显子
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内含子连接区，表2中所示的与大片段重排相关的7个基因的16个内含子区，表3中所示的ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C基因的275个骨架SNPs位点，以及表4中所示的56个SNPs位点；所述探针组包括SEQ ID NO:1～331所示序列的探针；NO:1～331所示序列的探针；
。2.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的探针组。3.权利要求1所述探针组的设计方法，其特征在于，步骤包括：
1）选择表1中的15个同源重组修复基因的全编码区和外显子
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内含子连接区、表2中的与大片段重排相关的7个基因的16个内含子区、表3中的高频发生纯合缺失的ATM、BRCA1、BRCA2、CDK12、CHEK1、CHEK2、RAD51C基因的275个骨架SNPs位点以及表4中的56个SNPs位点作为探针设计的基因目标区域；2）根据步骤1）选择的基因目标区域设计探针组的序列；3）将步骤2）设计好的探针进行blast和repeatmask，去除同源性较高和捕获区域重复的探针；4）统计经步骤3）过滤后所得探针序列的GC含量，去除GC含量少于20%的探针；5）统计探针设计未覆盖区域、同源性较高和捕获区域重复的探针区域，以及GC含量少于20%的探针区域，将这些区域分别延伸20bp，按照长度120bp、步长90bp的规则进行划分，将划分的区域进行blast、repeatmask及GC含量统计，去除同源性较高、捕获区域重复和GC含量少于20%的探针；6）将去除的区域按照上述步骤5）再进行设计，将无法覆盖或是覆盖不好的区域进行遍历叠瓦设计，最大限度地覆盖目标区域。4.同源重组修复基因的高通量测序方法，其特征在于，步骤包括：1）DNA样本制备；2）用权利要求1所述的探针组杂交捕获同源重组修复基因，并进行富集；3）进行高通量测序，并拆分测序数据，定义Q30≥85%的数据为合格下机数据；4）对合格下机数据进行预处理，去除建库过程中引入的接头序列、引物和低质量碱基片段；5）将碱基序列比...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹丹，章扬，尤红，杨晓霞，乔宗赟，徐小红，曹建军，
申请(专利权)人：苏州仁东生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：