伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用，更具体涉及细菌属的Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯。同时，还公开了所述酯合成酶JFN94_03506在水相体系催化合成白酒风味物质己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。因此，本发明专利技术提供了一种在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的酶和编码基因，具有较大应用价值。具有较大应用价值。

【技术实现步骤摘要】
伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及伯克霍尔德氏菌酯合成酶、编码基因及其应用，更具体涉及细菌属的Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的应用。
技术背景
[0002]浓香型白酒的主体物质是水和乙醇，以及少量风味物质如酯、酸、醇、醛、酮类化合物等。风味物质虽然含量仅占酒体总量的1％
‑
3％，却决定产品的感官和风味，是白酒中十分重要的组成物质。其中，己酸乙酯和辛酸乙酯是决定浓香型白酒品质的重要酯类物质。然而，由于白酒的主要生产过程为延续传统的固态发酵过程，酿造体系复杂，酿造过程的物料转化和风味物质生成机制的科学基础仍然不明晰，导致酿造过程产酯生香慢，即己酸乙酯、辛酸乙酯和其他酯类的合成效率低，降低了高品质白酒的生产效率，制约了产业的发展。虽然通过勾调过程外加化学香精己酸乙酯等可以提高酯含量，但感官品评表明此类产品品质较差，与传统发酵方式生产产品相比香味不协调，刺激性更强，缺乏酿造酒产品的“香气协调，绵柔净爽”的特点，明显影响了产品品质。探究己酸乙酯和辛酸乙酯等重要酯类的生成机制，对于确保浓香型白酒的产品品质具有重要作用。已有的研究表明，浓香型白酒固态发酵的主要驱动力为微生物的代谢，其中微生物所产酯合成酶对己酸乙酯和辛酸乙酯的合成具有显著贡献。
[0003]白酒的固态发酵酿造过程有多种微生物参与，呈现出复杂而独特的白酒微生物酿造区系。研究发现白酒来源的多种微生物均可以产生酯合成酶。然而，仅有部分菌种被报道具有酯的催化合成能力，包括细菌属的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis)，以及霉菌属的毛霉(Mucor sp.)、根霉(Rhizopus sp.)、多枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)、曲霉(Aspergillus sp.)和红曲霉(Monascus sp.)。然而由于白酒微生物的多样性和发酵过程物料转化的复杂性，到目前为止极少研究聚焦微生物来源催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的酯合成酶。因此，挖掘伯克霍尔德氏菌来源具有催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯能力的酯合成酶，有助于丰富白酒微生物源酯合成功能酶资源，相关酶资源的深入研究对于保障白酒中关键风味酯类的稳定合成，具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种伯克霍尔德氏菌酯合成酶JFN94_03506及其基因在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。
[0005]本专利技术提供一种伯克霍尔德氏菌酯合成酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]相应地，本专利技术提供所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因。优选方式中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术的伯克霍尔德氏菌酯合成酶是Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506，具有在白酒酿造的水相体系环境中催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的性能，所述酯合成酶JFN94_03506的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体的其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供含有所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因的表达载体。优选地，所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因与启动子可操纵连接。
[0009]进一步，本专利技术还提供所述的表达载体的宿主细胞。尤其是大肠杆菌细胞。
[0010]更进一步地，本专利技术提供所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶在制备己酸乙酯和/或辛酸乙酯中的应用。
[0011]在一个具体实施方式中，其是在水相体系中，以己酸和乙醇为催化底物，或者以辛酸和乙醇为催化底物，通过反应生成产物己酸乙酯或辛酸乙酯。优选地，所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶通过基因工作方法获得。更具体来说，所述的表达工程菌株的构建方法：提取伯克霍尔德氏菌总DNA，设计引物扩增基因，使用整合酶ClonExpress将基因整合到pET
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28a(+)表达载体上。经测序验证后，将此质粒通过化学转化法转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，通过IPTG诱导表达，获得携带酯合成酶JFN94_03506的大肠杆菌细胞。破碎细胞获得粗酶液，在水相体系催化底物己酸和乙醇或者辛酸和乙醇生成对应的酯，经气相色谱检测到产物己酸乙酯和辛酸乙酯。
[0012]本专利技术所述酯合成酶JFN94_03506可通过大肠杆菌工程菌诱导表达获得，用于在水相体系中催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯。
[0013]实验证实：经大肠杆菌工程菌诱导表达的酯合成酶JFN94_03506粗酶制剂，可以在含有1M乙醇和0.01M己酸或者辛酸的水相体系，催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯，产量分别为14.2mg/L和25.1mg/L。
[0014]因此，本专利技术利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得Burkholderia anthina BJQ0011来源酯合成酶JFN94_03506及其编码基因，并构建含有酯合成酶JFN94_03506编码基因的大肠杆菌表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶，并经催化体系验证具有在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力，己酸乙酯和辛酸乙酯的产量分别为14.2mg/L和25.1mg/L。本专利技术的酯合成酶JFN94_03506，可用于在白酒酿造的水相体系催化合成重要风味酯己酸乙酯和辛酸乙酯，因而可以用于白酒酿造中。
附图说明
[0015]图1酯合成酶JFN94_03506编码基因PCR扩增结果。
[0016]图2酯合成酶JFN94_03506编码基因诱导表达结果。
[0017]图3酯合成酶JFN94_03506催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯定量计算结果。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
[0019]实施例1酯合成酶JFN94_03506编码基因的克隆
[0020]1、伯克霍尔德氏菌的培养
[0021]在无菌操作条件下，将伯克霍尔德氏菌BJQ0011接种含有100mL发酵培养基的300mL三角瓶，摇床30
±
1℃，200
±
10r/min培养48h。所述发酵培养基，其组成为高粱5g/L、蛋白胨10g/L、NH4HSO
4 1g/L、K2HPO
4 1g/L、MgSO
4 0.8g/L、橄榄油10mL/L，调节pH为7.0，115℃灭菌20min。
[0022]2、伯克霍尔德氏菌DNA的提取
[0023]对上述培养48h的伯克霍尔德氏菌取样，采用BIOMIGA细菌DNA提取试剂盒提取总DNA。具体步骤如下：
[0024](1)将细菌培养物在LB培养基中过夜培养
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种伯克霍尔德氏菌酯合成酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因。3.如权利要求2所述的伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种含有权利要求3所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因的表达载体。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述所述伯克霍尔德氏菌酯合成酶的编码基因与启动子可操纵连接。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀婷，赵静溶，徐友强，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：