一种微量DNA靶向富集方法及其应用技术

本发明专利技术涉及测序技术领域，特别涉及一种微量DNA靶向富集方法及其应用。本发明专利技术所述的微量DNA靶向富集方法，包括如下步骤：S1：片段化基因组DNA的末端加A尾；S2：步骤S1所得加A尾的片段化的DNA与茎环接头连接成环状DNA；S3：对步骤S2所得环状DNA采用靶向引物滚环扩增富集；S4：构建测序文库。本发明专利技术获得方法是可以应用于微量DNA的、靶向富集效率高的、操作简便的捕获方法，可以用于靶向基因捕获及低频突变的检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
一种微量DNA靶向富集方法及其应用


[0001]本专利技术涉及测序
，特别涉及一种微量DNA靶向富集方法及其应用。

技术介绍

[0002]基于测序技术的目标区域捕获方法在科研和临床基因检测领域已被广泛应用。捕获测序技术由于只针对靶向区域进行检测，因此提高了测序数据利用率，降低了检测成本。目前，已有大量的捕获测序方法被开发，广泛用于肿瘤组织活检。随着技术的发展，液体活检受到了科研人员的广泛关注，其中部分研究成果已经应用到临床检测与治疗中。
[0003]血浆游离DNA(cfDNA)携带了正常细胞或肿瘤细胞中特有的基因信息和表观遗传信息，相对于组织活检取样的复杂性、危害性、不完整性，cfDNA对人体的伤害小，且便于多次取样用以长期监测肿瘤进展。然而，cfDNA在血液中的浓度非常低，通常正常人体中，每毫升全血的cfDNA含量在1
‑
10ng，这就对cfDNA的捕获测序带来了极大的影响，特别是针对肿瘤患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)其含量更低，在大量的非目的片段(cfDNA)的背景噪音中，使得检测相关靶向基因区域的突变带来误差。
[0004]针对微量DNA的富集，相关技术已被广泛应用。滚环扩增(RCA)作为一种核酸等温扩增技术，通过随机引物对微量DNA进行无差别的扩增，够在全基因组范围内对初始量低的DNA进行高质量的扩增富集，在微量DNA扩增领域已被广泛应用。但依旧存在大量的非目的片段(cfDNA)的背景噪音。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的为提供一种微量DNA靶向富集方法，本专利技术的方法解决了现有技术中的种种不足之处，获得一种可以应用于微量DNA的、靶向富集效率高的、操作简便的捕获方法，可以用于靶向基因捕获及低频突变的检测。
[0006]如果利用片段化的DNA与茎环结构接头连接得到环状DNA，那么形成的单链环具有在一个环中存在反向互补序列的特点；利用这一同一序列中存在反向互补序列的特征，可以设计一条匹配DNA序列的引物，该引物可以进行滚环扩增，同时通过超分支扩增形成双链DNA，同时双链DNA的反向互补序列打开后，可以在每一条链上在此与同一条引物结合，进一步进行扩增富集，即产生了一条靶向引物即可得到具有目标捕获区域的双链DNA的现象。这种特征又正好适用于具有链置换活性的DNA聚合酶进行滚环扩增，解决了由于随机引物产生的无差别的扩增问题，实现了靶向富集目的。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案：
[0008]一种微量DNA靶向富集方法，包括如下步骤：
[0009]S1：片段化基因组DNA的末端加A尾；
[0010]S2：步骤S1所得加A尾的片段化的DNA与茎环接头连接成环状DNA；
[0011]S3：采用针对步骤S2所得的环状DNA中靶向区域的靶向引物进行滚环扩增富集，所述靶向引物既为滚环扩增引物，同时能使滚环得到的单链DNA超分支扩增；
[0012]S4：构建测序文库。
[0013]优选的，所述的步骤S2结束后对环状DNA进行变性操作，使其成为单链环状DNA，再进行后续程序。
[0014]优选的，所述步骤S3中一个靶向区域对应一条靶向引物，所述靶向区域为一个或多个。
[0015]优选的，所述靶向引物的3
’
末端具有硫代修饰。
[0016]优选的，所述靶向引物的Tm值为滚环扩增所用聚合酶的最适反应温度。
[0017]优选的，所述片段化基因组DNA包括：经过机械打断的基因组DNA、经过酶切法打断的基因组DNA、外周血游离DNA、肿瘤游离DNA或自然降解的基因组DNA中的一种或多种。
[0018]优选的，所述的茎环接头的序列如SEQID NO.1所示。
[0019]优选的，所述片段化基因组DNA包括突变型内参DNA序列，所述的突变型内参DNA序列的核酸序列如SEQID NO.3所示，所述针对靶向区域的靶向引物序列如SEQID NO.4所示。
[0020]进一步优选的，所述步骤S3的具体操作如下：
[0021](1)构建扩增体系如下：
[0022]反应组分体积(μL)10X buffer2.5纯化的环状DNA17靶向引物(1μM)1dNTP(2.5mM)2100mM MgSO41.58U/μL Bst DNA聚合酶1总体积25
[0023](2)步骤(1)所述的扩增体系在PCR仪中运行：60℃，1h；80℃，10min，得到扩增产物。
[0024]优选的，所述用于构建测序文库的通用接头引物F的序列为SEQID NO.5：Index接头引物R的序列为SEQID NO.6。
[0025]前述任一项所述的方法在核酸检测方面的应用。
[0026]有益效果
[0027]本专利技术的一种微量DNA靶向富集方法采用片段化的DNA与茎环结构接头连接形成环状DNA，采用一条或一组靶向引物即可进行滚环扩增达到微量DNA的靶向富集效果。克服了采用PCR扩增富集的偏性以及液相杂交捕获的繁琐操作问题。
[0028]通过以上技术方案，本专利技术的一种微量DNA靶向富集方法具有的优点是：
[0029]1)捕获效率高：采用特异性引物进行滚环扩增，实现对靶向区域的高度富集；
[0030]2)低频突变的富集：通过对滚环引物的3
’
端引入突变，实现等位基因特异性富集作用；
[0031]3)操作简单：片段化的DNA直接与茎环接头连接即可成环，采用靶向引物进行滚环扩增即可得到大量靶向区域，省去杂交捕获的复杂过程；
[0032]4)成本低廉：采用一条或一组引物即可进行滚环扩增富集，通过茎环结构的序列设计，可以实现一步扩增即可完成测序文库构建过程，降低了捕获及建库成本。
附图说明
[0033]图1为本专利技术的一种微量DNA靶向富集方法流程示意图。
具体实施方式
[0034]下面将结合本专利技术的具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0036]下面结合实施例对本专利技术进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本专利技术。
[0037]下述实施例所用材料来源如下：
[0038]cfDNA来自实验室保存的人血浆里面提取得到；
[0039]野生型内参DNA、突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微量DNA靶向富集方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：片段化基因组DNA的末端加A尾；S2：步骤S1所得加A尾的片段化的DNA与茎环接头连接成环状DNA；S3：采用针对步骤S2所得的环状DNA中靶向区域的靶向引物进行滚环扩增富集，所述靶向引物既为滚环扩增引物，同时能使滚环得到的单链DNA超分支扩增；S4：构建测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2结束后对环状DNA进行变性操作，使其成为单链环状DNA，再进行后续程序。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中一个靶向区域对应一条靶向引物，所述靶向区域为一个或多个。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向引物的3
’
末端具有硫代修饰。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向引物的Tm值为滚环扩增所用聚合酶的最适反应温度。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段化基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文翔，王建国，白云飞，
申请(专利权)人：徐州海纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：