包含芳基硫酸酯酶A的重组载体及其在用于治疗异染性脑白质营养不良的干细胞治疗中的用途制造技术

提供了包含表达盒的重组慢病毒载体，所述表达盒包含表达ARSA基因的核酸构建体。所述载体可用于治疗异染性脑白质营养不良的基因治疗。提供了制备所述载体的方法。提供了包含载体的多能干细胞。还提供了培养干细胞以保持其多能性的方法。多能性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含芳基硫酸酯酶A的重组载体及其在用于治疗异染性脑白质营养不良的干细胞治疗中的用途
[0001]1.引言
[0002]本文描述了包含表达盒的重组慢病毒载体，所述表达盒包含表达芳基硫酸酯酶A基因的核酸构建体。所述载体可用于异染性脑白质营养不良的基因治疗。还公开了制备所述载体的方法。本文提供了包含所述载体的多能干细胞。还提供了培养所述干细胞以保持其多能性的方法，保持转染的干细胞多能性的介质和培养方法。
[0003]2.背景
[0004]异染性脑白质营养不良(MLD)是一种罕见的溶酶体贮积症，其由芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因中导致ARSA缺乏的突变引起。这种酶催化硫苷脂到半乳糖脑苷脂的降解途径的第一步。ARSA缺乏导致硫苷脂在中枢神经系统(CNS)的少突胶质细胞、小胶质细胞和某些神经元以及外周神经系统(PNS)的施旺细胞和巨噬细胞中的累积。这导致小胶质细胞激活、进行性变性、脱髓鞘和各种致命的神经症状，如严重的进行性运动和认知损害。
[0005]观察到三种类型的MLD：1.在婴儿期早期到晚期(最多到2岁)的婴儿发作型MLD，其为最常观察到的，占全部发病的50
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60％；2.青春期早期至晚期(2
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16岁)的青少年发作型MLD，占全部发病的30
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40％；和3.在16岁以后的成年期的成人发作型，占全部发病的5
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10％。据估计，每100000名新生儿中有1.4
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1.8名婴儿携带MLD，即每年约有1900名新患者。目前，全世界约有41000名患者。早期无典型症状。90％以上的患者诊断错误，错失了及时治疗疾病的机会。如果不经治疗，患者可能在婴儿期晚期的1
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2年内或青春期的6
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8年内遭受瘫痪和失明。
[0006]目前尚无临床证实的MLD治愈，直到最近，大多数MLD患者的治疗还限于支持性护理。目前正在开发多种治疗方案，并处于临床试验阶段。大多数是酶替代治疗(ERT)和造血干细胞移植(HSCT)。提供功能性ARSA的酶替代治疗(ERT)一直是具有挑战性的，因为ARSA是一种无法穿透血脑屏障(BBB)的高分子量蛋白质，因此显示有限的作用。如果造血干细胞不能穿过BBB，它们就不能分化为分泌有限的ARSA酶的小胶质细胞，所述ARSA酶被受体神经细胞吸收。
[0007]造血干细胞移植(HSCT)可以使选定的患有溶酶体贮积病的患者亚群受益。此外，干细胞移植消除了患者经历化学治疗的需要，所述化学治疗称为基于白消安的调理，以去除原始骨髓细胞并为基因校正的干细胞生长创造空间。该过程可能引入包括神经系统在内的多种病变的风险。通过仔细滴定(titration)治疗，调理治疗可以更加可耐受，移植后患者可以快速恢复，无明显副作用。此外，同种异体细胞移植存在移植物抗宿主病(GvHD)的风险，这可能是导致广泛发病的原因。与使用骨髓(BM)相比，使用来自匹配的无关供体的脐带血(UCB)的HSCT降低了急性或慢性GvHD的风险。
[0008]然而，由于其较低的细胞剂量和免疫学上的不成熟，使用UCB有更高的移植失败的可能性(Kamani等人(2012)Biol.Blood Marrow Transplant.18(8):1265
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1272；Locatelli和Pagliara(2012)Pediatr.Blood Cancer.59(2):372
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376)。HSCT在MLD中也显示出差的结果，结果不可预测，被证实在晚期婴儿发作患者中基本上无效。这凸显了在该领域中对创新
的治疗方法的需求。
[0009]3.概述
[0010]本文提供了携带ARSA基因盒以诱导来自干细胞的ARSA表达的慢病毒载体。在一个实施方案中，载体用于MLD基因治疗的临床试验。公开的载体实现了对ARSA的有效诱导。在某些实施方案中，以mRNA和蛋白水平评估载体的基因表达活性。在某些实施方案中，表征了ARSA表达对患者的影响。
[0011]本文提供了有效诱导ARSA基因并产生足够水平的ARSA以改善MLD的生理参数并用于临床基因治疗的载体。
[0012]本专利技术的一个实施方案是包含表达盒的重组慢病毒载体(LV)，所述表达盒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码ARSA多肽的ARSA基因。在一个实施方案中，LV是自身失活(SIN)慢病毒载体。
[0013]在某些实施方案中，所述载体包含在ARSA基因5
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启动子和ARSA 3
’
增强子控制下的重组ARSA基因。在一个实施方案中，所述重组ARSA基因包括外显子和内含子。在一个实施方案中，所述载体不包含ARSA基因内含子。
[0014]在一个实施方案中，所述载体包含绝缘子。
[0015]在一个实施方案中，所述载体包含Rev响应元件(RRE)。
[0016]在一个实施方案中，所述载体包含中央聚嘌呤区(central polypurine tract)。
[0017]在一个实施方案中，所述载体包含翻译后调节元件。
[0018]在一个实施方案中，所述转录后调节元件是修饰的土拨鼠转录后调节元件(“WPRE”)。
[0019]在某些实施方案中，所述修饰的WPRE具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
[0020]在载体的某些实施方案中，所述ARSA基因是人ARSA基因。在某些实施方案中，所述ARSA基因具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
[0021]本专利技术的另一个实施方案是用载体转导的宿主细胞。
[0022]在某些实施方案中，所述细胞是干细胞。
[0023]在某些实施方案中，所述细胞为自体干细胞。
[0024]在某些实施方案中，所述细胞为造血干细胞。
[0025]本文提供了在本文提供的培养基中使包含载体的慢病毒生长的方法。还提供了一种适合用于慢病毒的冷冻保存的介质。
[0026]本文提供了一种培养包含本文公开的载体的干细胞的方法，其中所述干细胞保持多能性。在某些实施方案中，培养基包含TPO、SCF、FLT3和IL
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3因子。在某些实施方案中，培养基包含抑制mTOR和ROCK活性的激酶抑制剂。在某些实施方案中，所公开的培养基中的HSC保持多能性并增加对LV感染的敏感性。
[0027]在某些实施方案中，培养基保持干细胞的多能性，并包含CP1、葡萄糖、2
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20％(或5
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10％)的白蛋白和赫赛汀。在一个实施方案中，干细胞是单核细胞干细胞。
[0028]本文公开了一种治疗受试者的异染性脑白质营养不良(MLD)的方法，所述方法包括将包含表达ARSA基因的载体的干细胞移植到受试者中。
[0029]还提供了一种保持如本文所述的宿主细胞的多能性和增加的对LV感染的敏感性的方法，包括在包含TPO、SCF、FLT3和IL
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3因子的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组慢病毒载体(LV)，其包含：编码芳基硫酸酯酶A多肽的芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因，其中所述LV是自身失活(SIN)慢病毒载体。2.权利要求1所述的载体，其中所述载体包含在ARSA基因5
’
启动子和ARSA 3
’
增强子控制下的重组ARSA基因。3.权利要求1或2所述的载体，其中所述载体包含绝缘子。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的载体，其中所述载体包含Rev响应元件(RRE)。5.权利要求1
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4中任一项所述的载体，其中所述载体包含中央聚嘌呤区。6.权利要求1
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5中任一项所述的载体，其中所述载体包含翻译后调节元件。7.权利要求6所述的载体，其中所述转录后调节元件是修饰的土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。8.权利要求7所述的载体，其中所述修饰的WPRE具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。9.权利要求1
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8中任一项所述的载体，其中所述ARSA基因是人ARSA基因。10.权利要求9所述的载体，其中所述ARSA基因具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。11.一种宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求1
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10中任一项所述的载体转导。12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是干细胞。13.权利要求12所述的宿主细胞，其中所述细胞是源自骨髓的干细胞。14.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是造血干细胞。15.一种保...

【专利技术属性】
技术研发人员：连祺周，
申请(专利权)人：港大科桥有限公司，
类型：发明
国别省市：