EHDV-2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及EHDV

【技术实现步骤摘要】
EHDV
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2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及流行性出血病病毒2型单克隆抗体、制备源细胞株及其试剂盒。

技术介绍

[0002]流行性出血病病毒2型简写EHDV
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2型。EHD
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2型属于EHD九种血清型中的一种。EHD不同的血清型毒株对牛的致病性差异较大。现有的研究认为仅EHDV
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2型的其中1个毒株
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茨城病病毒(Ibaraki virus，IBAV)对牛有较强致病性，其引起牛的突发高热、咽喉麻痹、关节疼痛性肿胀等症状。我国每年从国外进口10万
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20万头种牛，加强EHDV
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2型病毒抗体的监测，是保障我国种牛健康养殖的措施之一。
[0003]EHD抗体检测方法，现有中和试验(VN)、琼扩试验和ELISA检测方法，其中中和试验实验环境要求高，需要生物安全一定级别实验室进行，试验周期长3
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5天；琼扩试验需要有经验的实验员观察判定，不能数字显示检测结果；ELISA方法，通过酶联免疫分析仪读取，结果以数字化形式判定，客观、准确，具有较强的使用优势。本专利研制的EHD
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2型B
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ELISA抗体检测方法，主要针对EHD感染牛致病性的毒株产生的抗体检测而设计，具有显著的针对性，对于EHD感染牛的防控意义较大，同时研制的试剂盒其检测灵敏性、特异性等指标均与OIE推荐的类似方法相近。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题在于，利用制备的EHD
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2型单克隆抗体、EHD
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2型病毒包被的ELISA板，组装试剂盒，试剂盒检测指标达到国际认可的检测值。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案是，一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
[0006]使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。
[0007]上述的方法，包括以下步骤：
[0008](1)用纯化的EHDV
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2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；
[0009](2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV
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2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV
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2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5。
[0010]上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫A
型或Asia I型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。
[0011]上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对EHDV
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2病毒的抗原决定簇
[0012]上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与EHDV
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2病毒及EHD抗原有特异性免疫反应。
[0013]一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。
[0014]上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。
[0015]上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％Tween
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20的0.01mol/LpH7.4 PBST；稀释液为含1％～10％BSA、0.05％～0.5％Tween
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20pH7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1
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2mol/L H2SO4溶液。
[0016]上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：流行性出血病病毒2型抗原预包被板2块；EHD
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2型单克隆抗体0.3mL；强阳性对照0.6mL；弱阳性对照0.6mL；阴性对照0.6mL；HRP标记羊抗鼠二抗0.3mL；20倍浓缩洗涤液50mL；稀释液60mL；底物液25mL；终止液25mL；封板纸6张；说明书1份。
[0017]所述EHDV
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2型病毒包被板通过以下方法制备：
[0018]EHDV
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2病毒接种于长成单层的BHK21细胞，5％CO
2 37℃培养3d
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5d，细胞出现缩圆脱落后，
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20℃冻融细胞3次，收集病毒液。用pH4.0柠檬酸缓冲液透析24h，再用pH7.0 PBS透析24h，收集病毒液。病毒液中加入等体积饱和硫酸铵，沉淀2h，离心弃上清，取沉淀，用PBS溶解，作为包被用抗原。EHDV
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2型病毒抗原按照1:500～1:1000比列，用pH9.0
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10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h，洗板3次，用含1％～10％BSA PBS缓冲液封闭1h，PBST洗板，干燥1h～3h制得。
[0019]一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括：
[0020](1)使用EHDV
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2型抗原预包被板；
[0021](2)使用纯化的灭活EHDV
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2病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株EHD E2C5，取杂交瘤细胞上清，利用ProteinG柱纯化的EHDV
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2型单克隆抗体。
[0022]在本专利技术所述的试剂盒的制备方法中，还包括强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液，并将所述液体和EHDV
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2型抗原预包被板、EHDV
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2单克隆抗体分开放置。
[0023]本专利技术的试剂盒采用阻断ELISA检测牛、羊和鹿等动物血清EHDV
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2病毒抗体，可用于EHDV
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2及EHD其它血清型病毒血清抗体的快速检测和流行病学调查。
[0024]本专利技术有益效果为，试剂盒中EHDV
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2型病毒单克隆抗体通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，其特征在于：该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。2.使用权利要求1所述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)用纯化的EHDV
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2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；(2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV
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2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV
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2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5。4.如权利要求2或3所述方法制备产物的应用，其特征在于：所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫A型或Asia I型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。5.如权利要求2或3所述方法制备产物的应用，其特征在于：所述的流行性出血病病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾军，段博芳，韩佃刚，尹尚莲，刘敏，叶玲玲，祝贺，董仙兰，董俊，赵胜兰，
申请(专利权)人：韩佃刚，
类型：发明
国别省市：