用于多核苷酸测序的组合物和方法技术

本申请涉及用于多核苷酸测序的组合物和方法。利用目标多核苷酸通过孔的易位的分步易位步骤来表征目标多核苷酸，包括表征目标多核苷酸的序列的方法和组合物。苷酸的序列的方法和组合物。苷酸的序列的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
用于多核苷酸测序的组合物和方法
[0001]本申请是申请日为2014年11月26日，申请号为201480064725.5，专利技术名称为“用于多核苷酸测序的组合物和方法”的申请的分案申请。
[0002]相关申请的引用
[0003]本专利申请主张2013年11月26日提交的标题为“用于多核苷酸测序的组合物和方法”的美国临时专利申请No.61/909,316的权益，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。
[0004]序列表
[0005]本专利申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并且该序列表以其全部内容作为参考并入本文。创建于2014年11月25日的所述ASCII拷贝的名称为12957
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228_SL.txt和大小为19,778字节。
[0006]专利技术背景
[0007]本专利技术公开一般地涉及表征目标多核苷酸的方法和组合物，其包括表征目标多核苷酸的序列。
[0008]由于多核苷酸(例如，DNA或RNA)中编码的信息对医学和生命科学非常重要，因此需要快速且经济地对多核苷酸测序。目前，商品化测序技术需要样品和文库制备，两者均很费力。此外，对于多种应用，读取数据比预期更慢。因此，通量受限并且成本相对较高。纳米孔测序代表了正在开发的用于快速且廉价地对目标多核苷酸测序的一种新方法。
[0009]纳米孔测序利用了可以为离子电流提供通道的纳米孔。电泳驱动多核苷酸通过纳米孔，并且由于多核苷酸穿过纳米孔，因此它降低了通过纳米孔的电流。每个通过的核苷酸或一系列核苷酸获得了特征电流，并且对电流电平的记录对应于多核苷酸序列。由于一些电流电平取决于多个核苷酸(通常3
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4个)，因此仍需要改善目前工艺水平以改善准确度。由于多核苷酸易位通过纳米孔所获得的电流电平的任何其它信息可以提供优势，如形状和持久时间。
[0010]纳米孔测序的常见问题是多核苷酸通过纳米孔的易位过快以至于单个核苷酸的电流电平(current level)过短而难以分辨。纳米孔测序的一种方法涉及在抗电压电位的多核苷酸结合蛋白的引导下控制多核苷酸通过纳米孔的易位，所述结合蛋白如解旋酶、易位酶或聚合酶。尽管有这种控制易位，但是一些测序错误形式仍存在并且导致较差的测序准确度。
[0011]因此，仍需要提供进一步控制多核苷酸通过纳米孔的易位并且在核苷酸差异中更好地分辨核苷酸易位的方法和组合物。本专利技术公开满足了该需要并提供了相关优势。
[0012]专利技术概述
[0013]提供了表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括：(a)跨越与Hel308解旋酶(helicase)和目标多核苷酸接触的孔施加势差；(b)测量目标多核苷酸通过孔的一个或多个分步易位步骤产生的一个或多个信号；和(c)根据分步易位步骤的电信号，表征目标多核苷酸。目标多核苷酸的表征包括鉴别以下中的一个或多个：(1)目标多核苷酸的序列；(2)目标多核苷酸的修饰；(3)目标多核苷酸的长度；(4)目标多核苷酸的身份；(5)目标多核苷酸
ID NO：1具有至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％同源性的氨基酸序列。
[0037]项目20.根据项目1所述的方法，其中，所述孔为固态孔。
[0038]项目21.根据项目1所述的方法，其中，所述孔为生物和固态杂交孔。
[0039]项目22.根据项目21所述的方法，其中，所述生物和固态杂交孔为多肽
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固态杂交孔。
[0040]项目23.根据项目21所述的方法，其中，所述生物和固态杂交孔为多核苷酸
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固态杂交孔。
[0041]项目24.根据项目1所述的方法，其中，所述Hel308解旋酶为表1和2所示的解旋酶或其变体。
[0042]项目25.根据项目1所述的方法，其中，所述目标多核苷酸选自单链多核苷酸、双链多核苷酸和部分双链多核苷酸。
[0043]项目26.调节目标多核苷酸通过孔的分步易位步骤的方法，所述方法包括：
[0044](a)跨越与Hel308解旋酶和目标多核苷酸接触的孔施加势差；
[0045](b)将所述Hel308解旋酶与一定浓度的Hel308解旋酶底物接触，所述Hel308解旋酶底物的浓度不同于所述底物的参比浓度，所述底物浓度在分步易位步骤持续时间中所产生的变化与所述底物浓度与所述参比浓度相比的差异成正比，和
[0046](c)测量通过所述Hel308解旋酶的所述目标多核苷酸通过所述孔的一个或多个分步易位步骤所产生的一个或多个信号。
[0047]项目27.根据项目26所述的方法，还包括根据通过所述一个或多个分步易位步骤产生的一个或多个信号，表征所述目标多核苷酸。
[0048]项目28.根据项目27所述的方法，其中，表征所述目标多核苷酸包括鉴别以下中的一种或多种：所述目标多核苷酸的序列、所述目标多核苷酸的修饰、所述目标多核苷酸的长度、所述目标多核苷酸的身份、所述目标多核苷酸的来源和所述目标多核苷酸的二级结构。
[0049]项目29.根据项目26所述的方法，其中，所述势差包括电势差。
[0050]项目30.根据项目26所述的方法，其中，所述一个或多个信号包括电信号。
[0051]项目31.根据项目26所述的方法，其中，所述一个或多个信号包括光信号。
[0052]项目32.根据项目26所述的方法，其中，所述底物浓度为所述Hel308解旋酶底物的半饱和浓度。
[0053]项目33.根据项目26所述的方法，其中，所述参比浓度为所述Hel308解旋酶底物的饱和浓度。
[0054]项目34.根据项目26所述的方法，其中，所述底物和所述参比浓度两者均不是所述底物的饱和浓度。
[0055]项目35.根据项目26所述的方法，其中，所述底物浓度和所述参比浓度是所述Hel308解旋酶底物的半饱和浓度。
[0056]项目36.根据项目26所述的方法，其中，所述Hel308解旋酶底物为三磷腺苷(ATP)。
[0057]项目37.根据项目26所述的方法，其中，所述分步易位步骤包括所述Hel308解旋酶的完整易位循环的第一分步易位步骤。
[0058]项目38.根据项目26所述的方法，其中，所述分步易位步骤包括所述Hel308解旋酶
的完整易位循环的第二分步易位步骤。
[0059]项目39.根据项目26所述的方法，其中，所述目标多核苷酸的易位处于通过势差施加于易位通过所述孔的多核苷酸上的外加作用力的相反方向。
[0060]项目40.根据项目26所述的方法，其中，所述目标多核苷酸的易位处于通过势差施加于易位通过所述孔的多核苷酸上的外加作用力的方向。
[0061]项目41.根据项目30所述的方法，其中，所述电信号为选自电流、电压、隧穿、电阻、电位、电压、电导率和横向电测量的测量。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)跨越与Hel308解旋酶和目标多核苷酸接触的孔施加势差；(b)在完整易位循环期间，对移动通过所述孔的所述目标多核苷酸的至少一个核苷酸测量所述解旋酶的至少两个状态的信号；和(c)使用在(b)中测量的至少两个信号表征所述目标多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号是电信号。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述解旋酶的所述至少两个状态是可区分的。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Hel308解旋酶的完整易位循环包括核苷酸底物结合和核苷酸底物水解。5.根据权利要求1所述的表征目标多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)跨越与Hel308解旋酶和目标多核苷酸接触的孔施加势差；(b)在所述Hel30...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：