对具有非天然碱基对的核酸进行测序的方法技术

公开了一种对含有非天然碱基对(UBP)的核酸进行测序的方法，包括执行两个或更多个替换复制反应，其中使用非天然碱基对的两个或更多个中间体来复制核酸；对由替换复制反应产生的核酸进行测序；对经测序的核酸进行聚类并鉴定非天然碱基对的候选位置；确定在非天然碱基对的候选位置处，中间体至天然碱基对中每一个的转换率；根据与非天然碱基对的候选位置相邻的一个或多个天然碱基对的序列，比较中间体的转换率与预先确定转换率的文库；其中中间体的转换率与预先确定转换率的文库中的值的基本匹配证实了非天然碱基对的位置，从而确定含有非天然碱基对的核酸的序列。还公开了一种用于执行如本文公开的方法的装置。行如本文公开的方法的装置。行如本文公开的方法的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对具有非天然碱基对的核酸进行测序的方法


[0001]本专利技术涉及核酸化学。具体而言，本专利技术涉及对具有非天然碱基对的核酸进行测序的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]沃森
‑
克里克碱基配对(A
‑
T和G
‑
C)，是最基本的规则之一，不仅定义了地球上所有生物的中心法则，而且还定义了当前的基因工程技术。然而，这种排他性的碱基配对规则限制了生物技术的进一步发展，因为仅仅依赖四个字母的遗传字母表限制了核酸和蛋白质的功能性。为了克服这一限制，通过创造额外的人工碱基对(非天然碱基对，UBP)来扩展DNA的遗传字母表引起了研究人员的注意。
[0004]最近，已经产生了在复制、转录和/或翻译中起第三碱基对作用的几种UBP。其中，已经对Ds
–
Px(Ds：7
‑
(2
‑
噻吩基)
‑
咪唑并[4,5
‑
b]吡啶和Px：二醇
‑
修饰的2
‑
硝基
‑4‑
丙炔基吡咯)对和P
–
Z对进行了进化工程方法SELEX(通过指数富集的配体系统进化)，产生与靶蛋白和细胞特异性结合的含非天然碱基DNA(UB
‑
DNA)适配子。UB
‑
DNA适配子中的疏水性Ds碱基在增强适配子对靶标的亲和力方面起着重要作用。半合成细菌也通过并入一系列的其UBP，包括5SICS
–
NaM而产生。具有扩展的遗传字母表的细菌可以产生含有非天然氨基酸的蛋白质。
[0005]遗传字母表扩展技术的这些进展迅速增加了对涉及UBP的DNA测序方法的需求。特别是，通过SELEX产生UB
‑
DNA适配子需要一种测序方法，该方法可以确定富集文库中含有UB的每个适配子候选体的序列，所述富集文库是在SELEX中几轮选择和扩增程序后获得的不同序列的混合物。以前，开发了改良的Sanger测序方法用于含有Ds碱基的单个DNA克隆。在改进的Sanger测序方法中，Ds位置在天然碱基峰模式上显示为缺口。这种测序方法不仅用于UB
‑
DNA适配子生成，也用于半合成细菌的创建以确定UB位置。然而，为了执行这种测序方法，每个适配子候选克隆必须从富集文库中分离出来。换句话说，为了执行本领域的测序方法，需要预先知道Ds位置。如果Ds碱基的位置未知，则本领域的测序方法将不能对含有UBP的DNA进行测序。因此，需要提供一种对含有UBP的DNA进行测序的替代方法。
[0006]专利技术概述
[0007]在一方面，提供了一种对含有非天然碱基对(UBP)的核酸进行测序的方法，包括执行两个或更多个替换复制反应，其中使用非天然碱基的两个或更多个中间体来复制核酸；对由替换复制反应产生的核酸进行测序；对经测序的核酸进行聚类并鉴定非天然碱基对的候选位置；确定在非天然碱基对的候选位置处，中间体至天然碱基对中每一个的转换比率；根据与非天然碱基对的候选位置相邻的一个或多个天然碱基对的序列，比较中间体的转换比率与预先确定转换率的文库；其中中间体的转换比率与预先确定转换率的文库中的值的基本匹配证实了非天然碱基对的位置，从而确定含有非天然碱基对的核酸的序列。
[0008]在一些实例中，该方法包括两个替换复制反应。
[0009]在一些实例中，两个替换复制反应包括执行第一替换复制反应，其中使用非天然碱基对的第一中间体来复制核酸；和执行第二替换复制反应，其中使用非天然碱基对的第
二中间体来复制核酸。
[0010]在一些实例中，两个替换反应同时地、顺序地和/或分开地执行。
[0011]在一些实例中，第一中间体和第二中间体是非天然碱基对的不同中间体。
[0012]在一些实例中，非天然碱基对的中间体选自由Pa'、Pa、Pn和Px组成的组。
[0013]在一些实例中，非天然碱基对由选自由以下组成的组的核碱基组成：
[0014]7‑
(2
‑
噻吩基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Ds)；
[0015]7‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Dss)；
[0016]7‑
(2,2',5',2
”‑
三噻吩
‑5‑
基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Dsss)；
[0017]2‑
氨基
‑6‑
(2
‑
噻吩基)嘌呤
‑9‑
基基团(s)；
[0018]2‑
氨基
‑6‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)嘌呤
‑9‑
基基团(ss)；
[0019]2‑
氨基
‑6‑
(2,2',5',2"
‑
三噻吩
‑5‑
基)嘌呤
‑9‑
基基团(sss)；
[0020]4‑
(2
‑
噻吩基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(dDsa)；
[0021]4‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(Dsas)；
[0022]4‑
[2
‑
(2
‑
噻唑基)噻吩
‑5‑
基]吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(Dsav)；
[0023]4‑
(2
‑
噻唑基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(dDva)；
[0024]4‑
[5
‑
(2
‑
噻吩基)噻唑
‑2‑
基]吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(Dvas)；
[0025]4‑
(2
‑
咪唑基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(dDia)；和
[0026]Ds衍生物：
[0027]其中R和R'各自独立地代表由下式代表的任何部分：
[0028][0029]‑
CHO；
[0030]‑
SH；
[0031][0032][0033][0034][0035]其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.对含有非天然碱基对(UBP)的核酸进行测序的方法，包括执行两个或更多个替换复制反应，其中使用非天然碱基对的两个或更多个中间体来复制核酸；对由替换复制反应产生的核酸进行测序；对经测序的核酸进行聚类并鉴定非天然碱基对的候选位置；确定在非天然碱基对的候选位置处，中间体至天然碱基对中每一个的转换比率；根据与非天然碱基对的候选位置相邻的一个或多个天然碱基对的序列，比较中间体的转换比率与预先确定转换率的文库；其中中间体的转换比率与预先确定转换率的文库中的值的基本匹配证实了非天然碱基对的位置，从而确定含有非天然碱基对的核酸的序列。2.权利要求1的方法，其中该方法包括两个替换复制反应。3.权利要求2的方法，其中两个替换复制反应包括执行第一替换复制反应，其中使用非天然碱基对的第一中间体来复制核酸；和执行第二替换复制反应，其中使用非天然碱基对的第二中间体来复制核酸。4.权利要求2或3的方法，其中两个替换反应同时地、顺序地和/或分开地执行。5.权利要求3的方法，其中第一中间体和第二中间体是非天然碱基对的不同中间体。6.前述权利要求中任一项的方法，其中非天然碱基对的中间体选自由Pa'、Pa、Pn和Px组成的组。7.前述权利要求中任一项的方法，其中非天然碱基对由选自由以下组成的组的核碱基组成：7
‑
(2
‑
噻吩基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Ds)；7
‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Dss)；7
‑
(2,2',5',2
”‑
三噻吩
‑5‑
基)咪唑并[4,5
‑
b]吡啶
‑3‑
基基团(Dsss)；2
‑
氨基
‑6‑
(2
‑
噻吩基)嘌呤
‑9‑
基基团(s)；2
‑
氨基
‑6‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)嘌呤
‑9‑
基基团(ss)；2
‑
氨基
‑6‑
(2,2',5',2"
‑
三噻吩
‑5‑
基)嘌呤
‑9‑
基基团(sss)；4
‑
(2
‑
噻吩基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(dDsa)；4
‑
(2,2'
‑
二噻吩
‑5‑
基)
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶
‑1‑
基基团(Dsas)；4
‑
[2
‑
(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：平尾一郎，平尾路子，浜岛圣文，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：